柚皮中总黄酮粗提物的提取方法研究

陈含兴，戴文婕，刘黎瑶,,通信作者，王庆奎，丛方地

柚皮中总黄酮粗提物的提取方法研究

陈含兴a，戴文婕a，刘黎瑶a,b,通信作者，王庆奎b，丛方地a

（天津农学院，a. 基础科学学院，b. 天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300392）

柚皮含有大量的黄酮类化合物，具有增强免疫、抗氧化、抗炎等药用活性。本研究对柚皮中总黄酮类活性成分的提取方法进行了筛选优化。首先，选用超声辅助提取法，以总黄酮提取率为指标、乙醇作为提取溶剂，分别对乙醇体积分数、料液比、提取时间进行了单因素影响试验。然后，采用正交设计确定了最优提取条件，即：乙醇体积分数为30%、料液比（g∶mL）为1∶25，超声时间为90 min。在该提取条件下，柚皮中总黄酮提取率可达6.5%（/）。

柚皮；总黄酮；提取方法；单因素筛选；正交设计

柚皮占整个柚子的质量比例高达43%～48%。研究表明，柚皮中含有丰富的矿物质、维生素等人体必需的营养元素，还含有一些较高的黄酮类活性成分，比如柚皮苷、柚皮素、柠檬苦素及其衍生物等[1]。柚皮苷具有抗氧化及清除氧自由基能力。有研究表明，口服饲喂柚皮苷能够显著降低大鼠和小鼠肝脏及血浆中的胆固醇含量[2-4]。柚皮素是柚皮苷的苷元，属于二氢黄酮类化合物，具有显著的抗炎活性和细胞保护作用。研究发现，柚皮素可通过环磷酸鸟苷-蛋白激酶G信号通路抑制缺血/再灌注损伤心肌细胞凋亡，发挥保护受损心肌的作用[5]。另有研究表明，柚皮素通过下调脊髓P2X7R/PI3K/AKT信号，参与抑制脊柱炎症并减轻大鼠的骨癌疼痛[6]。

植物黄酮类成分提取方法有浸提法[7]、超临界流体萃取法[8]和微波辅助提取法[9]。浸提法耗时长、提取效率低。超临界流体萃取法和微波辅助提取法都需要用到特殊的设备，成本较高。综合考虑提取成本及提取效率等因素，本研究拟采用超声辅助有机溶剂提取法，以总黄酮提取率为评价指标、以乙醇作为提取溶剂，分别对乙醇体积分数、料液比、提取时间进行单因素影响试验，并采用正交设计确定最优提取条件，旨在为柚皮中总黄酮成分的提取提供参考，提高柚皮的资源利用率。

1 仪器与材料

1.1 仪器

恒温烘箱（Thermo Scientific，Heratherm OMS 100）；电子天平（Sartorius，TE4101-2）；旋转蒸发仪（Rotavapor R-100，BUCHI）；台式低速离心机（长沙湘仪仪器有限公司，L550型）；紫外-可见分光光度计（MAPADA，UV-3200）；高速粉碎机（北京燕山正德机械设备有限公司，YS-08）；超声波提取萃取仪（宁波新芝生物科技股份有限公司，Scientz-250C）等。

1.2 试药及材料

柚皮（市售沙田柚，购于天津市西青区红旗农贸市场）；芦丁（中国药品生物制品检定院，纯度≥98%）；甲醇、无水乙醇（天津市风船化学试剂有限公司，分析纯）；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 柚皮预处理

根据前期预干燥程序，对新鲜柚皮进行干燥预处理。

（1）烘干。取新鲜柚皮，削除黄色表皮，取白色内囊组织，于65 ℃恒温烘箱中烘干至恒重。

（2）粉碎。取烘干后的柚皮，撕成小块置于粉碎机中粉碎，将粉碎品过40目筛去除粗颗粒，得干燥的柚皮细粉。

2.2 总黄酮含量的测定方法

2.2.1 芦丁标准品的全波长扫描

称取芦丁标准品10 mg，加入甲醇溶解并稀释至适宜质量浓度，通过紫外-可见分光光度计测定200～900 nm波长区域内的吸收情况，并记录扫描图谱。根据全波长扫描结果确定测定总黄酮成分含量的最佳吸收波长[10]。

同法测定空白溶剂的全波长扫描图，确定其全波长扫描结果。

2.2.2 标准曲线绘制

称量芦丁标准品10 mg置于容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至25 mL，配制质量浓度为400 μg/mL的储备液。精密移取适量储备液并用甲醇稀释定容，得到质量浓度分别为4、8、16、20、24 μg/mL溶液。通过紫外分光光度法，测定该系列标准溶液在最大吸收波长处的吸光度，以质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线并拟合回归方程。

2.2.3 精密度测定

取2.2.2中配制的低、中、高质量浓度的标准溶液，连续进样5次，测定其在最大吸收波长下的吸光度，并计算相对标准偏差（值）。

2.2.4 柚皮粗提物中总黄酮含量的测定

称取适量柚皮粗提物（称量）至10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，2 000 r/min离心10 min，用0.45 μm孔径的微孔滤膜过滤，取滤液，经甲醇稀释适当倍数后，测定其在最大吸收波长下的吸光度，利用标准曲线的回归方程，计算柚皮粗提物中的总黄酮含量（总黄酮）和总黄酮提取率。

2.3 柚皮总黄酮粗提物的提取方法研究

2.3.1 总黄酮成分的提取过程

根据文献[10-12]及前期试验结果，采用不同体积分数的乙醇作为提取溶剂。总黄酮粗提物提取过程为：准确称取一定质量的柚皮粉碎物，加入一定体积的提取溶剂，经超声提取一定时间后，离心（4 000 r/min×10 min），取上清液，旋蒸去除溶剂，置于恒温烘箱（65 ℃）干燥12 h即得。

2.3.2 单因素影响试验

（1）乙醇体积分数的筛选。在保持料液比（g∶mL）为1∶20、超声时间45 min的前提下，分别设定提取溶剂中乙醇体积分数为10%、30%、50%、80%、100%（无水乙醇），以总黄酮提取率为筛选指标，筛选乙醇体积分数的范围。

（2）料液比筛选。在保持乙醇体积分数为50%、超声时间45 min的前提下，分别设定料液比为1∶5、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，以总黄酮提取率为筛选指标，对料液比范围进行筛选。

（3）超声时间筛选。在保持料液比为1∶20、乙醇体积分数为50%的前提下，分别设定超声时间为30、45、60、90、120 min，以总黄酮提取率为筛选指标，对超声时间范围进行筛选。

2.3.3 正交设计试验

根据单因素试验结果，以总黄酮提取率为筛选指标，通过三因素三水平（L9，34）正交设计，对乙醇体积分数（%，A）、料液比（g∶mL，B）、超声时间（min，C）进行筛选。正交设计因素水平表如表1所示。

表1 正交设计因素水平表

水平因 素 乙醇体积分数/%（因素A）料液比/g∶mL（因素B）超声时间/min（因素C） 1301∶1545 2501∶2060 3801∶2590

2.4 验证试验

在优选提取方法下，分别提取3批柚皮总黄酮粗提物，测定并计算总黄酮提取率，对该提取方法进行验证性考察。

3 结果与分析

3.1 总黄酮含量测定

3.1.1 全波长扫描

按照既定方法，测定芦丁标准溶液及空白样品溶液在200～900 nm波长范围内的吸收情况，全波长扫描图谱如图1所示。

图1 芦丁标准品溶液全波长扫描图谱

由图1可知，芦丁在362.5 nm处有强吸收峰，因此确定测定总黄酮的最适波长为360 nm，在该最大吸收波长下，溶剂无紫外吸收，不干扰含量测定。

3.1.2 标准曲线绘制

采用紫外分光光度法测定不同质量浓度的芦丁溶液在360 nm处的吸光度，并以吸光度对芦丁溶液质量浓度进行线性回归。回归方程为：＝0.028 7＋0.001 0（2＝0.999 9）。测定结果（图2）表明，在检测波长360 nm下，芦丁标准品溶液的吸光度与其质量浓度在0～24 μg/mL范围内线性关系良好。

图2 芦丁标准品溶液标准曲线

3.1.3 精密度测定

对低、中、高质量浓度的芦丁标准品溶液进行精密度测定，结果如表2所示。由表2可知，不同质量浓度溶液重复测定5次的值均小于2%，表明该测定方法的精密度良好。

表2 精密度测定结果

质量浓度/μg·mL-1A1A2A3A4A5`A±SDRSD/% 40.119 70.120 00.119 80.120 20.119 70.119 9±0.000 20.18 160.459 90.460 30.461 30.460 10.461 00.460 5±0.000 60.13 240.690 20.690 20.689 90.689 30.689 20.689 8±0.000 50.07

3.2 柚皮中总黄酮粗提物的提取

3.2.1 单因素影响试验

按照既定方法，对提取过程中的3个关键因素——乙醇体积分数、料液比、超声时间的适宜范围进行了单因素影响试验，结果如表3所示。结果表明，当乙醇体积分数、料液比、超声时间分别为30%～80%、（1∶15）～（1∶25）以及45～90 min时，粗提物中的总黄酮提取率较高，并在峰值前后呈先升高后下降的趋势，适宜后续继续进行正交设计筛选。

表3 单因素影响试验筛选表

样品编号乙醇体积分数料液比超声时间提取率 %g∶mLmin% 1 10 1∶20453.30 2 30 1∶20455.06 3 50 1∶20455.28 4 80 1∶20455.04 5100 1∶20451.51 6 501∶5454.86 7 50 1∶15455.01 8 50 1∶20455.11 9 50 1∶25455.03 10 50 1∶30455.12

续表

样品编号乙醇体积分数料液比超声时间提取率 %g∶mLmin% 1150 1∶20 305.35 1250 1∶20 455.62 1350 1∶20 605.89 1450 1∶20 905.84 1550 1∶201205.51

3.2.2 正交设计

通过三因素三水平（L9，34）正交设计，以总黄酮提取率为评价指标，对乙醇体积分数、料液比及超声时间进行了正交筛选，筛选出提取柚皮中总黄酮成分的最佳方法，结果如表4所示。通过极差分析，得出最优提取方法组合为A1B3C3，即：乙醇体积分数为30%、料液比为1∶25、超声时间为90 min。

表4 正交设计评价结果

样品编号乙醇体积分数（A）/%料液比（B）/g∶mL超声时间（C）/min提取率/% 1301:15455.01 2301:20605.30 3301:25906.65 4501:15605.54 5501:20905.62 6501:25455.41 7801:15904.69 8801:20454.86 9801:25604.92 k 15.6855.1105.122 k 25.5235.2605.251 k 34.8215.6585.655 R0.8640.5480.533

3.3 验证性试验

按照筛选出的最优提取方法，分别提取3批柚皮总黄酮粗提物，计算出总黄酮提取率约为6.5%（/）（表5），且各批次的提取率相差不大，说明该提取方法的提取效率稳定可靠。

表5 验证性考察

批次总黄酮提取率/%均值±SDRSD/% 16.726.58±0.121.87 26.53 36.49

4 讨论

4.1 提取液的处理方法

以往研究多选择使用趁热抽滤的方法来获得粗提液[13-14]，但在本研究中发现，柚皮总黄酮粗提液在趁热抽滤之后仍有一些细小的固体颗粒状杂质，且趁热抽滤的速度很慢。为了尽可能减少固体杂质对吸光度的影响，本试验选用趁热离心的方法替代趁热抽滤的过程，并将离心后的待测液用滤膜过滤以去除不溶性杂质的影响，这也是本试验有别于已有文献的地方。

4.2 影响总黄酮提取率的因素

在本研究中，总黄酮提取率随提取溶剂乙醇体积分数的升高呈先升高后降低的趋势。在提取率到达峰值之前，随着乙醇体积分数的升高，提取溶剂的整体极性不断增大，提高了黄酮类成分的溶出，从而提高了总黄酮的提取率。在峰值之后，提取率出现降低的趋势，可能是由于乙醇体积分数过高使得其他杂质也同时浸出，影响了黄酮类成分的溶出度。另外，在单因素试验中，考虑到长时间的超声提取有可能增加其他成分的浸出，影响了后期纯化[12]，因此本研究中并未研究超声提取120 min之后的情形。

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Optimization of extraction method for total flavonoids from pomelo peel

Chen Hanxinga, Dai Wenjiea, Liu Liyaoa,b,Corresponding Author, Wang Qingkuib, Cong Fangdia

（Tianjin Agricultural University, a. College of Basic Science, b. Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, Tianjin 300392, China）

Pomelo peel contains lots of flavonoids, these pomelo peel flavonoids exhibit immune enhancement, antioxidant, anti-inflammatory activities. Thus, the extraction methods of total flavonoids in pomelo peel were optimized in this study. Firstly, extraction rate of total flavonoids was taken as the evaluation index, and ethanol concentration, solid-liquid ratio and extraction time was determined through single factor screening. Then, the optimum formulation of flavonoids extraction was determined by orthogonal design. In the optimum extraction method, the ethanol concentration was 30%（）, the solid-liquid ratio was 1∶25（g∶mL）, and the ultrasonic time was 90 min. Under optimal method, extraction rate of total flavonoids could reach 6.5%（/）。

pomelo peel; total flavonoids; extraction method; single factor screening; orthogonal screening

1008-5394（2023）02-0049-05

10.19640/j.cnki.jtau.2023.02.010

P641.131；S152.72

A

2021-08-24

大学生创新创业训练计划项目（202010061071）；天津市教委科研计划项目（2017KJ181）

陈含兴（1999—），男，本科在读，主要从事药物制剂方面的研究。E-mail：2331891226@qq.com。

刘黎瑶（1988—），女，讲师，博士，主要从事药物制剂方面的研究。E-mail：519947324@qq.com。

责任编辑：宗淑萍