生鲜乳中嗜冷菌的分离鉴定及其对乳品品质的影响研究

赵娟娟 吴荣荣

（衡水学院生命科学学院 河北 衡水 053000）

随着人们生活水平的提高，对生鲜乳的需求不断增加，其质量问题倍受消费者的重视。在日常生活中，各种包装的液体乳制品经常产生涨包、蛋白分离、存在异味等现象，主要原因是原料乳质量不过关，特别是嗜冷菌总数过高[1]。

国际乳品联合会将7 ℃及以下依然能生长繁殖的微生物定义为低温菌，将能在20 ℃及以下生长繁殖，且最适生长温度在10 ℃～15 ℃的微生物定义为嗜冷菌。在多数情况下，嗜冷微生物不会直接引起严重的乳品变质现象。但嗜冷菌分泌的蛋白酶和酯酶等代谢产物难以用高温灭活，在冷藏过程中产生影响食品风味的苦味、腐败味、酸臭味等物质或形成凝胶[2,3]。同时在生产设备表面形成难以清除的生物膜，对食品生产可能带来持续污染。本项目拟从原料乳中分离出嗜冷微生物中最具代表性的荧光假单胞菌，并对嗜冷菌进行鉴定，同时研究嗜冷菌对乳品品质的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 鲜牛奶。采自衡水武邑丰犇奶牛养殖专业合作社。

1.1.2 培养基。培养基A：IDF 标准中规定的嗜冷菌检测用营养琼脂平板，其组成成分：酵母提取物2.5 g、胰蛋白胨5.0 g、脱脂奶粉1.0 g、葡萄糖1.0 g、琼脂10 ～15 g、蒸馏水1 000 ml。培养基B：在培养基A 的成分中加入1I.U.penicillin。

1.1.3 主要仪器与设备。超净工作台、生化恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、乳品成分分析仪等。

1.2 嗜冷菌的分离方法。将采集的鲜牛奶置入灭菌的三角瓶中，4 ℃下保藏48 h 后接种于琼脂平板中，25 ℃下培养48 h 后移接于肉汤培养基中，25 ℃下增菌培养48 h；接入A、B 培养基制成的琼脂平板中，25 ℃下培养48 h。镜检，对比分菌结果。

1.3 嗜冷菌的生理生化特性鉴定

1.3.1 形态染色。按常规涂片法进行革兰氏染色。

1.3.2 动力性实验。将菌在琼脂培养基上连续划线后刺穿管底，在25 ℃下培养24 h。

1.3.3 41 ℃不生长实验。荧光假单胞菌可以在4 ℃～37 ℃范围内生长。将纯化后的菌株用液体培养基活化过夜，取0.1 ml 涂布，41 ℃培养2 d，观察菌株是否生长。

1.3.4 乙醇抑菌实验。培养基灭菌后加入8%的无水乙醇。取0.1 ml 活化后的菌液涂布平板后置于25 ℃条件下培养2 d，观察菌株是否生长。

1.3.5 蛋白酶实验。荧光假单胞菌能分泌多种蛋白分解酶。配制牛奶培养基，取0.1 ml 活化的菌株涂布平板后置于25 ℃下恒温培养24 h，观察是否产生透明晕圈。

1.3.6 脂酶实验。荧光假单胞菌能表达脂肪酶。培养基灭菌后加入1%吐温-80。取0.l ml 活化的菌株涂布平板后置于25 ℃下恒温培养24 h，观察是否产生晕圈。

1.3.7 过氧化氢实验。在灭菌载玻片上滴加5%的H2O2，挑取菌株在H2O2溶液中轻轻划线，观察是否生成气泡。

1.3.8 明胶液化实验。将菌落穿刺接种在明胶培养基内，置于25 ℃下培养24 h，取出放入冰箱内10 ～30 min，如仍呈溶解状即为明胶液化实验阳性，如凝固不溶为阴性。

1.3.9 精氨酸双水解酶实验。将菌落接种于精氨酸双水解酶生化管，培养基变红为阳性，仍为黄色为阴性。

1.3.10 糖发酵实验。将菌落分别接种于木糖、甘露糖、果糖、麦芽糖生化管，25 ℃培养24 h 后，如果培养基变黄为阳性，仍为紫色为阴性。

1.3.11 荧光素试验。将细菌在改良金氏B 琼脂斜面培养基上端连续划线后刺穿管底，于25 ℃下培养24 h，用紫外线灯照射(波长360 nm)，出现黄绿色荧光为阳性。

1.4 嗜冷菌对乳品品质的影响。用乳品成分分析仪对不同温度贮藏下的牛乳中的脂肪和蛋白质含量进行测定，比较嗜冷菌对乳品品质的影响[4]。

2 结果与分析

2.1 嗜冷菌的分离。经培养可见培养基表面有灰白色菌落生长，边缘整齐、湿润，直径0.5 ～1.5 mm，挑取菌落时呈黏液状(如图1)。移接于肉汤培养基中25 ℃下增菌培养48 h，出现均匀浑浊菌落生长，沿管壁表面有白色菌膜形成(图2)。从镜检结果可以看出，本实验所分离得到的嗜冷菌在培养基B 上生长更好，且经显微观察，菌体形态更佳。大多数革兰氏阴性菌对青霉素有抵抗能力，再加上分菌前的低温处理，使得嗜冷菌的生长优势得到了巩固。所以在分离嗜冷菌时，应进行样品的预处理，并采用培养基B 配方。

图1 琼脂平板分菌

图2 肉汤增菌

2.2 嗜冷菌的鉴定结果。分离的嗜冷菌的生理生化特性鉴定结果见表1。2.3 嗜冷菌对乳品品质的影响。不同贮藏温度下嗜冷菌对乳品中脂肪和蛋白质含量的影响见表2 ～4。可以看出，随着贮藏温度的升高，嗜冷菌得以在更接近最适生长温度的环境下生长，繁殖速度增长明显，再加上由嗜冷菌释放的生物酶在较高温度下活力的增强，乳制品的脂肪含量、蛋白质含量都随贮存天数的增加而减少，且变质速度加快，货架期明显变短。

表1 生理生化特性鉴定

表2 5 ℃保藏乳品的变化

表3 10 ℃保藏乳品的变化

表4 15 ℃保藏乳品的变化

3 结论与讨论

利用不同培养基对生鲜乳中的嗜冷菌进行了筛选，确定培养基B 较适宜。通过生理生化特性鉴定，结果为荧光假单胞菌。用乳品成分分析仪对不同温度贮藏下的牛乳中的脂肪和蛋白质含量进行测定，结果表明，乳制品的脂肪含量、蛋白质含量都随贮存天数的增加而减少，且变质速度加快，嗜冷菌对乳品品质存在较大影响。