恶性腹水与卵巢癌转移、耐药相关性研究进展

吴怡楠,徐友娣,李玉娟

[南京医科大学附属南京医院(南京市第一医院) 妇产科,江苏 南京 210006]

腹腔内大量液体积聚称腹腔积液,临床上也称为腹水。由恶性肿瘤局部浸润或转移引起的腹腔积液称恶性腹水,恶性腹水通常与卵巢、子宫内膜、结直肠、胃、胰腺和腹膜恶性肿瘤相关,其出现往往提示肿瘤进展至晚期,是预后不良的标志。恶性腹水可引起呼吸困难甚至窘迫、腹部压痛和疼痛、恶心厌食、疲劳以及运动障碍等多种症状,极大程度上降低了患者的生活质量。同时体液调节失衡将导致机体发生水肿、蛋白质丢失和严重的电解质紊乱。腹腔液体积聚还会促使腹部感染和败血症的发生、发展,尤其是在晚期恶性肿瘤患者中[1]。卵巢肿瘤(OC)是常见的妇科肿瘤,其中卵巢恶性肿瘤起病隐匿,晚期缺乏有效治疗手段,因此致死率高居妇科恶性肿瘤之首[2]。卵巢上皮癌(EOC)是临床上常见的卵巢恶性肿瘤,组织学上可分为Ⅰ型(低级别浆液性、黏液性、低级别子宫内膜样、透明细胞)和Ⅱ型(低分化、癌肉瘤、高级别浆液性、高级别子宫内膜样),其中最常见且最具侵袭性的亚型是高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)[3]。大多数初次诊断的HGSOC患者和几乎所有复发病例中均存在恶性腹水,且腹水出现的频率越高、量越大,提示预后越差[4]。恶性腹水中包含大量细胞与非细胞成分,可通过多种途径影响细胞代谢,导致肿瘤转移、化疗耐药以及减瘤手术可切除性降低,作者将对恶性腹水在卵巢癌的发展中如何作用,以及其与卵巢癌转移、耐药相关性的研究进展进行综述。

1 卵巢癌腹水

1.1 腹水的产生与组成

腹膜是覆盖于腹、盆腔内壁及大部分腹、盆腔器官表面的一层浆膜,由间皮细胞和少量结缔组织构成。腹膜含有丰富的毛细血管及淋巴管,其中毛细血管通过膜上大量孔状结构进行细胞和物质交换,腹膜液则经浆膜层上的淋巴管开口被吸收。在生理条件下,腹膜腔内大约存在100 ml的游离液体以润滑浆膜表面。腹膜腔内液体平衡主要受门静脉压力、渗透压、水钠平衡以及血管对大分子物质和细胞通透性的影响。正常情况下,几乎2/3的腹膜液通过分布于膈下的淋巴管被重吸收。最终,在胸内负压的作用下,腹膜液通过纵隔淋巴管和右胸导管到达右锁骨下静脉[1]。

卵巢癌腹水的发生机制复杂且受多种因素影响,目前人们普遍认为腹水积聚是淋巴管阻塞、毛细血管通透性增加以及肿瘤细胞和活化的间皮细胞分泌可溶性因子的综合结果。恶性腹水作为一种特殊的基质,含有相当丰富的细胞成分与非细胞成分,主要包括单个或成团的肿瘤细胞、成纤维细胞、间皮细胞、内皮细胞、多种免疫细胞如巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞,以及无细胞DNA和白介素6、8、10(IL6、8、10),血管内皮生长因子(VEGF),肿瘤坏死因子(TNF),肿瘤生长因子(TGF),干扰素(IFN)等多种信号分子[5]。这些信号分子由腹水中的细胞代谢产生,并通过各种途径介导细胞行为。

1.2 腹水中的信号分子

腹水中的可溶性信号分子与卵巢癌经各种途径发生转移有关,包括腹腔种植转移、血行转移和淋巴转移。因此,了解这些信号分子的表征对理解腹水如何影响卵巢癌进展以及协助临床诊断、分期和预后判断至关重要。研究表明,卵巢癌腹水环境中存在多种细胞因子、趋化因子和生长因子。与良性腹水、正常或患病血清相比,卵巢癌腹水中的一些因子显著升高[6]。

腹水中发现的趋化因子包括CCL2、3、4、5、8、22,趋化因子受体包括CCR1、2a、3、4、5、8,其中CCL2最为丰富。促肿瘤生长因子中,IL4、5、6、8、10、13和TGF-β具有很强的免疫调节功能以及血管生成作用;IL6、IL8、IL10、CCL2、IFN-γ和TNF-α升高与不良预后有关。目前血清IL6水平升高已被提议作为预测晚期卵巢癌总生存期(OS)的独立因素[7],其主要通过抑制细胞凋亡、刺激血管生成、增加肿瘤迁移和侵袭以及刺激细胞增殖参与EOC的进展。同时,在卵巢癌的体外研究[8]中,IL6升高被证实与紫杉醇和顺铂耐药有关。此外,新辅助化疗可降低血清及腹水IL6和IL8水平并改善生存结果[9]。卵巢癌患者循环血浆内IL6水平较正常血浆升高超过2倍;而与血浆相比,恶性腹水中的IL6水平升高接近100倍,这提示卵巢癌腹水是一种高度促进转移和炎症性的环境[10]。IL6作为腹水中特异性的炎症细胞因子,结合其测定水平或可优化卵巢癌风险算法(ROMA)——这是一种根据患者的绝经状态结合其血清CA125和人附睾蛋白4(HE4)水平被广泛应用于卵巢癌风险评估的算法[11]。值得关注的是,IL6在晚期恶性疾病的鉴别方面最为有效[12]。卵巢癌患者腹水中同时存在较高水平的IL10,并且当IL10水平升高,患者的无进展生存期(PFS)缩短。然而,近期一项关于腹水中IL10浓度对无细胞和浓缩腹水再输注治疗(CART)患者预后影响的研究显示,CART后IL10水平更高,生存期更长,这一结果提示IL10水平存在一定的变异性[13]。

VEGF在多种导致恶性腹水的肿瘤中过度表达,在实体肿瘤患者腹水和血清中的浓度升高,且与疾病分期呈正相关[14]。最近一项临床研究[15]表明,腹腔内应用重组人血管内皮抑素可提高伴有腹水的胃癌患者的疗效和生存率,提示抗血管生成可能是治疗恶性腹水的一种新的有效疗法,这一结果为卵巢癌出现恶性腹水时的治疗提供新思路。例如,紫杉醇加卡铂(TC)是晚期卵巢癌的经典化疗方案,在此基础上加入贝伐珠单抗腹腔灌注形成TCB方案。已有研究证实TCB方案可显著降低晚期卵巢癌患者血清CA125水平和腹水体积并提高减瘤手术满意程度,为延长PFS和减少术后并发症提供了更有效的治疗策略[16]。VEGF是肿瘤血管生成最主要的驱动因素,除此之外,TGF-β、IL6和IL8也被认为具有血管刺激性并与PFS呈负相关[17]。TGF-β2和TGF-β1在卵巢上皮癌患者的腹水中升高,TGF-β1升高尤为显著。然而,并不是所有TGF-β超家族成员都会升高,例如BMP的一个子集可低于正常循环中发现的水平,因此需要谨慎对待所有的TGF-β超家族成员[18]。TGF-β信号转导通路阻断的治疗策略强调腹水中高TGF-β的存在及其信号机制在腹水驻留细胞中的参与[17],该治疗策略不仅在临床前模型中消除腹水形成,而且抑制VEGF的生成并改善淋巴管对腹水的引流。除了通过脉管系统对腹水发展的直接作用,TGF-β也是卵巢癌细胞和多细胞球体聚集体中上皮间质可塑性的关键驱动因素[19]。此外,TGF-β可调节间质细胞和免疫细胞群的数量,这将与其他细胞因子共同增加肿瘤负担并促进恶性腹水形成[20]。

细胞因子和生长因子源于免疫细胞、基质细胞和肿瘤细胞的分泌,病变的宿主组织包括网膜和腹膜器官也参与其中。例如,CD163阳性的巨噬细胞通过诱导卵巢肿瘤微环境中VEGF、IL6和IL10的分泌来增强肿瘤血管生成和转移[21]。在不同患者和研究之间,被检测到的生长因子、细胞因子和趋化因子的种类常常不同,检测到的相对水平也是高度可变的。这提示如果这些可溶性因子在将来被用作生物及预后标志物,筛选方法需要标准化。

1.3 腹水中的物质代谢

EOC患者腹水和体内肿瘤模型的代谢组学、脂质组学和蛋白质组学研究强调了腹水中存在一些具有关键特征的代谢物及其重要性,这些代谢物对于调节腹水中肿瘤和肿瘤相关细胞的代谢是不可或缺的。

与良性腹水相比,恶性腹水显示出不同的代谢库。例如,主成分分析可通过亚油酸和油酸酰胺的存在及高1-磷酸葡萄糖、3-磷酸甘油、胆固醇和神经酰胺水平来区分卵巢癌腹水和肝硬化腹水。相反,2-羟基异戊酸、羟乙酸盐、葡萄糖、呋喃糖和果糖在恶性腹水中的含量低于肝硬化腹水[22]。恶性腹水中的葡萄糖、呋喃糖、羟乙酸盐和果糖水平显著降低,而3-磷酸甘油和1-磷酸葡萄糖水平增高,这几种糖代谢中间产物的改变表明腹水驻留细胞对葡萄糖的消耗增加[22-23]。

脂质积累也是恶性腹水的常见特征[22-24],与腹水驻留细胞脂肪生成和脂肪酸氧化增加有关。检测到的脂类包括腹膜组织中的脂肪细胞和肿瘤细胞进行脂质生物合成所产生的长链脂肪酸,同时也包括信号传导脂质。长链脂肪酸的类型似乎也是腹水特有的。脂质组学分析发现,不饱和脂肪酸(UFA)较饱和脂肪酸(SFA)在患者腹水中的积累水平更高。此外,在特定条件下的腹水或网膜衍生培养基培养的卵巢癌细胞系中发现,UFAs/SFAs增高[24]。腹水中较高的UFA水平可能反映了长链脂肪酸的生物合成增加,它被合成、储存并用作肿瘤细胞β氧化的燃料。腹水中富含的多不饱和脂肪酸包括前列腺素、羟基二十碳四烯酸、白三烯、亚油酸、二十二碳六烯酸和前列腺素E2。

磷脂在EOC腹水中也被检测到。与良性腹水相比,恶性腹水中的溶血磷脂酸(LPA)和鞘氨醇1-磷酸(S1P)水平升高,而高水平LPA与不良结局有关[25]。此外,恶性腹水中的钙非依赖性磷脂酶2(PLA2)活性更高。PLA2对磷脂酰胆碱(PtdCho)的分解至关重要,可生成溶血磷脂酰胆碱(lyso-PtdCho),lyso-PtdCho在恶性腹水中的含量较良性腹水更高[26]。

其他代谢中间产物在恶性腹水中也发生显著改变。体内肿瘤研究发现,β-羟丁酸(BHB)在腹水中的含量升高[27];BHB是脂肪酸分解氧化的中间产物之一,由乙酰乙酸经β-羟丁酸脱氢酶催化还原而成的一种酮体。与肝硬化腹水相比,2-羟基异戊酸是恶性腹水中消耗最多的代谢物之一,但其减少的原因尚不清楚[23]。许多代谢物如氨基酸等变化的原因和产生的后果仍需进一步调查和分析。

2 恶性腹水与卵巢癌转移及耐药的相关性

2.1 恶性腹水与卵巢癌转移的相关性

卵巢恶性肿瘤可通过血行转移或淋巴转移,但大多数卵巢癌主要通过腹膜腔种植转移。这种跨体腔扩散往往更加迅速,因为恶性细胞可依据腹膜液体动力学到达腹膜间皮层进行播种。这种被动转移导致细胞沉积物优先分布于仰卧位腹腔内液体积聚的区域(道格拉斯腔和右膈下),以及如网膜这种持续广泛暴露于腹水的区域,从而引起继发性腹膜癌[28]。这是一种更加弥漫广泛的转移形式,会对手术的可切除性产生不利影响。

恶性腹水富含促肿瘤的细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶,因此被认为是肿瘤微环境的一种独特形式,这一特征因其在转移耐药中的重要性而得到认可。从卵巢癌患者恶性腹水中提取的无细胞上清液显示,通过下调钙黏蛋白E、间隙连接蛋白43、封闭蛋白和桥黏连蛋白的表达,从而降低间皮细胞之间紧密连接的强度,协助跨间皮迁移、促进肿瘤转移过程[29]。还有更广泛的证据表明,腹水通过将癌细胞转变为干细胞样表型,参与促进上皮-间充质转化(EMT)。卵巢上皮细胞转化为间充质表型本是正常生理过程的一部分,这一过程增强了细胞活力和增殖,以便在释放卵母细胞时修复表面上皮细胞。EOC患者常在早期发生腹膜周围侵犯,而肿瘤干细胞具有自我更新和分化的能力,从而提高了它们对化疗的耐受性,尤其是在多细胞球体中。因此,EMT一直被认为是卵巢癌侵袭、转移和化疗耐药的主要因素[30]。最近有研究表明蛋白L-异天冬氨酸-O-甲基转移酶(PCMT1)为卵巢癌转移的关键驱动因子。PCMT1是一种蛋白质修复中的关键酶,其从卵巢癌细胞中释放并与细胞外基质中的层黏连蛋白β3(LAMB3)连接,通过激活整合素-FAK-Src途径促进癌细胞黏附、侵袭和转移。此项研究的体内实验结果还显示,PCMT1过度表达与腹水形成有关,且其表达与卵巢癌的转移分期呈正相关,提示其血清水平可能成为一项反映卵巢癌转移倾向的标志物[31]。

2.2 恶性腹水与卵巢癌耐药的相关性

在30多年的使用中,铂类药物仍然是晚期卵巢癌患者细胞减灭手术后最常见的化疗选择。卵巢癌患者通常对化疗反应良好,但是肿瘤常会复发。超过80%的卵巢癌患者化疗后复发,彼时却缺乏其他治疗选择,目前这仍是一项重大的临床挑战[32]。近期Reader等[33]首次描述了人卵巢癌细胞和卵巢表面上皮中的微触手(McTNs)。微触手是基于微管的突出物,可能影响自由漂浮细胞的转移潜力和化疗耐药性,是卵巢癌治疗的新靶点,对其生物学的了解可能会对改进治疗有帮助,包括腹腔内给药。复发和(或)化疗耐药在临床上通常表现为腹水进展、CA125水平升高,CT或PET-CT扫描表明存在疾病的放射学证据。在接受化疗时或在完成一个治疗周期后不久出现腹水被认为是不良预后的标志和可能产生化疗耐药性的证据。

导致腹水和化疗耐药之间关联的一个潜在因素是高度致瘤细胞球体的存在[34]。细胞球体是存在于卵巢癌相关腹水中并可以从中分离出来的细胞(癌细胞和非癌细胞)的聚集体。球体的大小和结构可以变化。在球体模型系统中已被证实化疗药物的使用和经典细胞毒药物的功效会受到限制[35]。一项研究[36]表明,与卵巢癌细胞系的单细胞群相比,球形细胞群对顺铂的耐药性要高出4倍。由于较深的核心细胞缺氧,球体内的静止状态也被假定为与化疗耐药有关。也有研究[37]表明,球体的核心实际上可能由间皮细胞而非肿瘤细胞主导,因此,需要进一步的研究来阐明靶向球体是否为有用的治疗策略。另外,球形和单层卵巢癌细胞之间的DNA稳定性、基因转录和表观遗传模式存在差异,这可能提示二者之间的药物敏感性和转移潜力也存在差异[38],而这些差异的实际意义尚待确定。

越来越多的证据表明,腹水的非肿瘤成分在促使化疗耐药的发生方面具有重要意义,如腹水中的胆固醇会上调卵巢癌细胞系中多药耐药蛋白1(MDR1)外排泵的表达,反之胆固醇的消耗可抑制顺铂耐药的发生[39]。然而,在大多数被研究的细胞系中,胆固醇消耗与紫杉醇耐药的发生没有显著关联。因此,在与实际应用一致的情况下,胆固醇诱导的顺铂耐药的重要性尚未得到证实。

3 腹水与卵巢癌预后

影响卵巢癌预后最重要的因素是原发肿瘤和转移性肿瘤的可切除性,在肿瘤最佳切除的情况下患者生存率最高。肿瘤晚期腹水的存在会使减瘤手术可切除性降低,且会缩短患者的PFS及OS。一些研究[40-41]发现,没有或仅有少量腹水出现的卵巢癌患者其生存期往往更长。

腹水可存在于所有卵巢癌亚型中[4]。然而在大多数已发表的研究中,可能由于队列规模较小,对多种卵巢癌亚型以及腹水与PFS和(或)OS之间关系的分析并未根据亚组进行分层。因此目前尚不能明确腹水在一些罕见的卵巢癌亚型及其进展中的重要性。腹水的存在与疾病程度显著相关,超过90%的Ⅲ期和Ⅳ期卵巢癌患者存在腹水。少数研究将低级别浆液性卵巢癌(LGSOC)与HGSOC进行比较,结果显示两个级别的肿瘤患者腹水存在显著差异,HGSOC患者的腹水发病率更高[4]。

很多研究还对术中腹水量与手术结果和复发模式之间的关系进行了调查,发现腹水量较大的患者OS明显缩短。一项包含685例患者的大型研究[42]表明,腹水量>2 L的患者PFS和OS显著缩短。2019年一项对210例HGSOC患者的分析发现,少量腹水(定义为<200 ml)较大量腹水(定义为>1 L)患者的CA125水平更低、手术结局更好、复发时间间隔更长[34]。

腹水中的成分也与预后有关,包括存在的细胞数量和类型以及信号分子。正如前文所述,IL6、IL8、VEGF以及TGF水平升高与不良预后相关,而IL10在不同研究中的结果存在一定差异。腹水中的肿瘤细胞聚集体可能会导致化疗失败和预后不良。免疫细胞的存在及其数量也会影响预后。据报道,CD4+/CD8+降低以及CD8+效应T细胞水平升高与更长的PFS有关[43],这强调了腹水中发生的细胞相互作用与疾病进展之间的关系。研究腹水来源的信号分子和细胞图谱在化疗过程中、病情缓解期和复发期如何变化会提供十分宝贵而有效的信息,这些信息经过更深入的研究或许可成为可靠的预后标志,并在未来为不同的治疗策略提供指示。