自噬在干眼病中的作用及调节自噬药物的研究进展

张迪,梁琦,胡凯

(南京大学医学院附属鼓楼医院 眼科,江苏 南京 210008)

干眼病是一种以泪膜稳态丧失为特征,伴有眼部不适症状的多因素眼表疾病,其中泪膜不稳定、泪液高渗、眼表炎症损伤和神经感觉异常是主要的病理因素[1]。据统计,干眼病全球患病率为5%～50%,我国为21%～30%[2-3],且有患病率逐年增长和患病人群低龄化的趋势。干眼病的临床症状如眼表干燥、异物感、烧灼感、瘙痒感等严重影响患者的工作和生活质量,甚至导致抑郁症等心理问题[4]。干眼病核心的发病机制是泪液高渗促进眼表细胞产生肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素1β(Interleukin-1β, IL-1β)等炎症因子,并招募免疫细胞如辅助性T细胞1和17至眼表,过度的炎症和氧化应激造成眼表细胞凋亡以及腺体和角膜神经损伤,加重泪膜不稳定和泪液高渗,从而形成恶性循环。眼表稳态失衡以及炎症、氧化应激等损伤是干眼病疾病进展的关键因素[5]。

自噬是细胞收到应激信号时重要的防御过程,在维持眼部细胞稳态中发挥着重要作用[6]。自噬主要包括3种形式:巨自噬、伴侣介导的自噬和微自噬。其中,巨自噬(以下简称“自噬”)是自噬的主要形式,是指胞质内容物被脂质双层膜包裹形成自噬小体,随即与溶酶体结合,被其中蛋白酶降解的过程[7]。线粒体自噬是一种特殊的自噬形式,其过程是靶向功能障碍的线粒体进行清除,从而抵御氧化应激损伤,近年成为眼科疾病机制研究的新方向[8]。除此之外,自噬也是一种细胞死亡方式,在受到刺激时自噬过程加重细胞损伤[9]。Lin等[10]用印迹细胞学的新型冷冻切片技术观察自噬标记物微管相关蛋白1轻链3(MAP1LC3,LC3),发现临床缺水性干眼患者细胞中的自噬应激程度高于正常人,且泪液中自噬相关蛋白5(autophagy related protein 5, ATG5)也被证明可作为干燥综合征型干眼有潜力的诊断标志物[11],表明自噬可能参与了干眼病的发病机制。此外,靶向调节自噬治疗干眼病的相关药物研究也越来越多,我们对相关研究进行总结,以期通过探究自噬机制为干眼病的临床治疗提供新角度。

1 自噬在干眼病发病机制中的作用

自噬对干眼病的作用具有双面性,一方面,激活自噬可以帮助恢复眼表代谢稳态并减轻炎症及氧化应激损伤;另一方面,自噬也可介导细胞死亡,加重眼表细胞的损伤,从而促进疾病的进展。

1.1 自噬在眼表的保护作用

1.1.1 自噬在眼表代谢稳态中的保护作用 泪膜是眼表的重要屏障,由脂质、水样液和黏蛋白构成,起着润滑、抗菌、屈光等多种作用[12]。在眼表的黏蛋白中,催泪蛋白(Lacritin)是一种由泪腺和睑板腺分泌的保护性蛋白,在眼表起着稳定泪膜、促进泪液分泌、维持上皮稳态的重要作用[13-14],在干眼病患者的泪液中Lacritin含量下降[15]。在Wang等[16]的研究中,在体外使用炎症因子刺激角膜上皮细胞以模拟干眼眼表的炎症环境,发现Lacritin可通过快速触发叉形头转录因子O亚型3蛋白蛋白乙酰化及其与自噬相关蛋白101偶联来诱导角膜上皮的自噬,从而维持眼表上皮的稳态。

最近有研究提出了干眼疾病进展中“副炎症”的概念,这是一种介于基础和慢性炎症之间的状态。在干眼病的初期,副炎症响应外部和内部刺激因素的应激信号,帮助恢复和维持眼表稳态;当刺激长久存在,副炎症转变为慢性炎症,激活适应性免疫反应,干眼病发展为慢性的损害性疾病。由此,学者提出自噬作为一种细胞内的清洁机制,可在干眼病副反应时期消除炎性小体或功能障碍的线粒体,阻断疾病进展,是极具价值的疾病治疗靶点[17]。胰岛素样生长因子结合蛋白3(insulin like growth factor binding protein 3, IGFBP-3)是一种由角膜上皮细胞分泌的蛋白。Stuard等[18]发现,干眼病中泪液高渗的刺激会破坏眼表的代谢稳态,具体表现为角膜上皮糖酵解活动抑制、线粒体功能障碍、炎症反应加剧。而IGFBP-3在高渗应激条件下,起着调控代谢稳态、恢复平衡的关键作用。随后,他们团队进一步研究[19]表明,IGFBP-3在角膜上皮中的保护作用与BNIP3L/NIX和MFN2介导的线粒体自噬有着密切联系,并且这一结论在结膜上皮细胞中也得到了验证。

1.1.2 自噬在眼表炎症中的保护作用 眼表免疫炎症被认为是干眼发病过程中的核心[20],自噬在调节免疫炎症过程中的作用已被广泛研究,TNF-α、γ干扰素等炎症因子也可以反向调节自噬水平[21]。

眼表炎症引起角膜细胞的损伤,尤其是角膜上皮细胞。有学者在体外使用高渗培养基处理角膜上皮细胞后观察到炎症介质(TNF-α、IL-1β等)以及自噬标志物Atg5、LC3、Unc-51样激酶1(ULK1)和Beclin1表达量的增加,且自噬激活剂雷帕霉素的应用可以抑制炎症并促进细胞存活,对干眼病有保护作用[22]。Ma等[23]在干眼小鼠角膜中观察到自噬水平的轻微上升,并在使用自噬激活剂(LYN-1604)和抑制剂(3-甲基腺嘌呤)之后观察小鼠角膜的炎症因子水平以及临床指标(泪液分泌水平和角膜荧光素钠染色评分),结果表明激活自噬可以降低小鼠眼表炎症水平并改善干眼病的临床症状,抑制自噬则效果相反。

眼表炎症也可导致泪腺细胞的损伤,而白细胞介素1(interleukin-1, IL-1)家族成员在其中的作用最为显著,Zoukhri等[24]发现向小鼠眶外泪腺注射IL-1α,早期会导致泪腺腺泡和导管上皮细胞的丢失,加重泪液分泌减少的症状,但在注射7 d之后,炎症反应消退,泪液分泌恢复到正常水平,表明泪腺有针对炎症的自我修复反应。随后该团队对泪腺修复的机制进行了深入探究,结果发现,注射早期小鼠泪腺腺泡细胞中自噬泡数量增加,LC3和溶酶体相关膜蛋白1的含量升高,表明炎症发生后自噬参与了泪腺的修复过程[25]。在此基础上,有团队对泪腺修复中自噬激活的具体机制进行了研究,结果表明缺氧诱导因子1α信号的增强可上调自噬水平以防止腺泡细胞损伤并维持正常的泪腺功能[26]。

1.1.3 自噬在眼表氧化应激中的保护作用 氧化应激是干眼病病理过程中的重要环节。泪液高渗会增加眼表活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生,破坏氧化还原平衡,最终诱发氧化应激反应[27]。氧化应激一方面可引起细胞内脂质过氧化和DNA损伤[28],另一方面激活核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)炎症信号通路,加重眼表炎症,促进干眼病的疾病进展[29]。

有研究团队在体外用过氧化氢对人角膜上皮细胞进行处理,发现可加重氧化应激损伤导致细胞死亡,并抑制了细胞的自噬活性[30]。随后他们发现雷帕霉素可以上调自噬水平以抵抗氧化损伤,在体外初步验证了干眼病中氧化应激与自噬过程的联系。香烟烟雾等环境污染已被证明可引发眼表氧化应激,导致泪液不稳定和眼表上皮损伤,成为干眼病的危险因素。Miao等[31]用香烟烟雾暴露作为人角膜上皮细胞和小鼠的病理条件,结果显示,烟雾通过损伤自噬正常清除受损蛋白质的过程,导致氧化应激反应加剧,而半胱胺可以通过增加自噬活性来减轻相关损伤并改善小鼠角膜上皮细胞的状态。在此基础上,Wang等[32]探究了眼表氧化应激损伤自噬的机制,结果表明眼表DNA损伤诱导转录物4(DNA damage inducible transcript 4,DDIT4)的表达升高会引发氧化应激,进而导致角膜上皮细胞的自噬受损和细胞活力降低,敲低DDIT4的表达可恢复正常自噬过程并减轻相关损伤。这些研究共同验证了眼表自噬受损是氧化应激造成病理损伤的重要环节,增强自噬活性对于改善干眼病的症状十分重要。

1.2 自噬在眼表损伤中的作用

1.2.1 自噬在泪腺和睑板腺损伤中的作用 在干眼病的疾病进展中,自噬作为一种细胞死亡方式,可造成泪腺损伤。有研究表明,机体血液中血清素含量持续下降会导致泪腺自噬性细胞死亡和腺泡萎缩,阻碍泪液的分泌[33]。

眼表炎症诱导的睑板腺功能障碍可造成泪液脂质缺少,破坏泪膜稳定性,增加泪液蒸发,是干眼病最常见的原因[34]。临床证据显示使用碳酸酐酶抑制剂类的青光眼药物可诱发睑板腺功能障碍[35],成为干眼病的危险因素。Han等[36]用碳酸酐酶抑制剂多佐胺处理人睑板腺上皮细胞,发现多佐胺可通过提升细胞中溶酶体数量和自噬体轻链标志物表达来影响细胞分化,进一步导致睑板腺的功能受损,促进干眼病的进展。

1.2.2 自噬在角膜神经损伤中的作用 角膜神经数量减少和敏感性增加会影响疼痛信号的传递和处理,这是干眼病患者眼部慢性疼痛症状的主要原因[37]。CD25是白细胞介素2受体的重要组成部分,与调节性T细胞的免疫调节作用有关[38]。有研究表明,缺乏CD25的小鼠更容易患干眼病,表现为眼表细胞凋亡和炎症浸润[39]。Stepp等[40]在此基础上探究了CD25缺失导致干眼病的机制,研究结果显示,在CD25敲除的干眼病小鼠中观察到自噬蛋白(LC3、Beclin1等)表达增加,表明CD25缺失通过上调感觉神经自噬性死亡的水平导致其形态改变和功能降低,加速了干眼病的疾病进程。

2 靶向调节自噬治疗干眼病的药物

2.1 靶向激活自噬的药物

2.1.1 雷帕霉素 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)可以通过阻止自噬起始分子ULK1的激活,从而抑制自噬启动,是自噬负调控的主要靶点。雷帕霉素是靶向抑制mTOR的自噬激活剂[41]。有研究[42]表明,静脉注射纳米颗粒包裹的雷帕霉素结合蛋白聚合物可显著改善小鼠泪腺中炎症细胞浸润的情况,在此过程中自噬调控基因ULK1和ULK2的表达显著升高。内质网应激是干眼病发病机制研究的新方向,衣霉素可诱导内质网应激造成泪腺毛细血管脱落和腺泡萎缩,最终引发干眼病。因此,有团队以此为疾病模型研究[43]显示,腹腔注射雷帕霉素可增加LC3B的含量,从而保护泪腺血管和腺泡细胞来改善干眼病。但雷帕霉素的注射给药有生物利用度低、副作用大、流程繁琐等缺点。所以,有团队尝试使用聚乙二醇等材料包裹雷帕霉素制成滴眼液进行治疗,发现雷帕霉素滴眼治疗可通过上调ULK1的表达而发挥缓解泪腺炎症、增加泪液分泌并改善眼表状态的作用[44]。衰老也是干眼病重要的危险因素,眼表组织的老化可导致泪腺萎缩和纤维化以及睑板腺功能障碍等病理变化。Trujillo-Vargas等[45]对衰老小鼠进行雷帕霉素滴眼治疗,结果也显示了雷帕霉素对衰老所致的眼表炎症和杯状细胞丢失等症状的改善效果。这些结果表明了雷帕霉素调节自噬活性在干眼病中的治疗潜力,有望成为干眼病治疗的新选择。

2.1.2 海藻糖 海藻糖是一种天然的双糖,早在2002年,海藻糖已经成为治疗中重度干眼病有效且安全的药物[46]。一项临床研究招募了9名干眼病患者,用海藻糖和羧甲基纤维素进行对比治疗,发现海藻糖能更好缓解干眼病的症状,对其机制进行深入探究发现,海藻糖通过自噬激活和对丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)炎症通路的抑制来缓解眼表的炎症[47]。而另一项临床研究显示,与单独使用透明质酸钠(一种常用人工泪液的成分)治疗干眼病相比,在其中加入海藻糖可使治疗效果更显著[48]。这些临床试验显示了海藻糖治疗干眼病的临床价值。关于海藻糖调控自噬的机制研究发现,与雷帕霉素不同的是,海藻糖激活自噬不依赖于mTOR通路,而是作用于转录因子EB(transcription factor EB, TFEB),它的功能为调节细胞内的自噬-溶酶体途径,海藻糖通过促进TFEB入核以提高自噬通量来缓解干眼病的炎症反应[49-50]。如今,海藻糖已成为市售滴眼液的主要成分,也有研究证明了这类滴眼液可通过激活自噬的方式来发挥对干眼病的治疗效果[51]。

2.1.3 褪黑素 褪黑素是一种由松果体分泌的主要成分为吲哚胺的激素,具有抗氧化和抗炎的显著特性[52],大量研究证明了褪黑素对自噬尤其是线粒体自噬的调控,对神经退行性疾病、缺血再灌注损伤以及癌症等疾病起有益作用[53]。Wang等[54]先在体外用叔丁基过氧化氢处理人角膜上皮细胞的模型中进行验证,结果表明褪黑素通过激活血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)通路来挽救角膜上皮细胞受损的自噬通量以显著改善线粒体功能,减少ROS的累积并抑制细胞凋亡,随后在干眼小鼠模型中发现腹腔注射褪黑素明显改善了临床症状。Xu等[55]用共聚胶束的材料负载褪黑素以提高药物在水溶液中的溶解度和生物活性,结果表明,褪黑素共聚胶束可通过激活PINK分子介导的线粒体自噬来改善干眼病相关的眼表损伤。

2.1.4 骨化三醇 骨化三醇是维生素D3的活性代谢物,具有抗炎和抗凋亡的作用,已被证明具有治疗干眼病的潜力[56]。Lyu等[57]研究表明,用骨化三醇治疗可以通过激活维生素D受体(VDR)信号通路以增加自噬通量,从而减轻干眼病中细胞凋亡引起的病理损伤。

2.2 靶向抑制自噬的药物

随着研究深入,更多的药物被证明通过靶向调节自噬来缓解干眼病,但调节自噬的机制不同。α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH)是一种具有免疫调节和抗炎功能的神经肽,Chu等[58]研究表明,在干眼病的应激刺激下,自噬过度激活可以促进炎症增强和细胞凋亡,而α-MSH的治疗通过作用于酪氨酸激酶JAK-STAT信号通路中的上皮生长因子受体而降低自噬水平,从而改善病变并保证眼表正常的功能。有研究[59]表明,长期服用抑郁症的主要药物选择性5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine, 5-HT)会加重干眼病中的眼表炎症和上皮细胞凋亡。因此,有学者猜测5-HT1A受体抑制剂(WAY-100635)可以改善干眼病的症状,结果表明WAY-100635通过抑制ROS的累积来抑制自噬水平从而在干眼病中发挥保护作用[60]。

3 结 语

干眼病的公认机制是泪膜不稳定和眼表免疫失衡,随着研究的深入,我们对疾病的病理变化不断有着新的认知。自噬作为细胞内重要的代谢过程,在干眼病的疾病进展中起着双重的作用。一方面,自噬帮助清除多余或有害的细胞成分,起到维持稳态和减轻损伤的作用;另一方面,过度的自我降解可促进细胞损伤,推进干眼病的进程。然而总体来看,自噬在干眼病中的保护作用更加显著,关于激活自噬延缓疾病进展的分子机制和靶向激活自噬的药物可能是该研究领域的热点,相关研究可帮助我们进一步认识和治疗干眼病。