四种非营养性饲料添加剂对澳洲淡水龙虾消化酶活力、免疫功能及离体消化率的影响

宋雪飞，周 庆*，张迎颖，张志勇，王 岩，恽台红

(1.江苏省农业科学院农业资源与环境研究所，国家农业科学农业环境六合观测实验站，农业农村部长江下游平原农业环境重点实验室，江苏 南京 210014；2. 常州市武进区前黄镇农技农机站，江苏 常州 213172)

澳洲淡水龙虾(Cheraxquadricarinatus)又名红螯螯虾，为甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、拟鳌虾科(Parastacidae)、滑鳌虾属(Cherax)动物，因具有许多水生生物学和水产商业特性，而成为既热门又重要的养殖经济物种之一[1]。但近年来随着养殖环境恶化，饲料中抗生素类添加剂的滥用所带来的细菌耐药性、药物残留、抗病力减弱等负面影响[2-6]，以及水体污染及病害暴发等一系列问题，不仅严重困扰着澳洲淡水龙虾养殖业的规模化发展，也对人类健康存在潜在的威胁[7-9]。因此，研究出无污染、无残留、无耐药性的绿色环保型的非营养性饲料添加剂，是当前推动澳洲淡水龙虾养殖产业健康发展的关键所在。

非营养性饲料添加剂不仅可以降低养殖成本，还可以提高水产经济效益和生态效益，其在国内水产养殖中的应用现状及发展态势愈来愈受重视。已有研究报道，非营养性饲料添加剂中草药提取物、胆汁酸、微生态制剂可在一定程度上提高水产动物的生长性能[10-11]。柠檬酸作为一种酸化剂、抗应激剂，在猪、鸡等畜禽动物方面已有很多报道[12-13]。在水产动物方面，有研究发现在不改变对虾饵料基础配方的前提下，添加柠檬酸可提高其生长速度，降低饲料系数和成本[14-15]，但在水产饲料中柠檬酸添加量一般不超过0.5%[16-17]。复合酶应用于水产养殖方面，可提高水产动物对饲料消化吸收率和免疫力，改善动物消化机能和水产养殖生态环境[18]。黄峰等[19]研究发现，对水产动物饲料添加外源复合酶，不仅可提高草鱼对饲料的消化率，还提高了其特定生长率和增重率。益生菌可定植于水产养殖动物肠道内，平衡宿主肠道微生物区系或调节机体黏膜，促进营养物质消化吸收，增强养殖对象的免疫力[20-21]。研究发现乳酸菌和芽孢杆菌作为饲料添加剂，可明显促进水产养殖动物的生长、提高肠道消化酶活性和增强机体的免疫力[22-24]；投喂芽孢杆菌可以改善养殖鳜(Sinipercachuatsi)的池塘水质[25]；枯草芽孢杆菌和光合细菌的复合菌对淡水养殖水质也具有净化作用[26]。目前，对根瘤菌在农业上的应用已有许多研究，但在水产养殖领域的应用较少。李海兵等[27]研究发现饲料中添加根瘤菌对中国对虾(Penaeuschinensis)仔虾的肠道具有保护作用。管振国等[28]研究发现饲料中添加根瘤菌的最适剂量为 2 g/kg，可以提高凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)存活率、肥满度、特定生长率、抗氧化酶活性及增强抗病能力，促进凡纳滨对虾生长。

澳洲淡水龙虾是1992年引进的品种，近年才逐步受到市场青睐[29]。目前，针对澳洲淡水龙虾非营养性饲料添加剂的研究报道较少，因此筛选获得适合澳洲淡水龙虾生长的饲料添加剂很有必要。本研究探讨了4种非营养性饲料添加剂对澳洲淡水龙虾肝胰腺消化酶、免疫酶活力及离体消化率的影响，筛选出适宜的非营养性饲料添加剂，旨在为澳洲淡水龙虾饲料配制提供参考，促进澳洲淡水龙虾养殖业的持续健康发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

澳洲淡水龙虾由苏州恒洋澳龙农业科技有限公司提供。澳洲淡水龙虾的饲料为中山统一企业有限公司生产的南美白对虾配合饲料。该饲料粗蛋白质含量≥41%、粗脂肪含量≥4%；其主要原料组成依次为鱼粉、面粉、豆粕、乌贼内脏粉、鱼油、大豆磷脂油、维生素、矿物质等。柠檬酸购于南京杰百柯生物科技有限公司；复合酶制剂购于青岛根源生物科技有限公司；益生菌选用的是植物乳杆菌(LactobacillusplantarumBNCC192567)，购自北京北纳创联生物技术研究院；枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisB2 )和根瘤菌(Rhizobiumrosettiformans3-20)均来自江苏省农业科学院农业资源与环境研究所污染水体生态修复团队实验室筛选的保藏菌株。

1.2 饲料制备

根据预实验数据结果以及相关文献[30-33]，本试验分别将柠檬酸、复合酶制剂用纯水稀释至0.2%，再均匀地喷洒到饲料上，编号依次为Ⅰ号和Ⅱ号饲料。Ⅲ号饲料添加1∶1的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌、Ⅳ号饲料添加1∶1的根瘤菌和枯草芽孢杆菌。Ⅲ号和Ⅳ号饲料添加方式均是将益生菌稀释至1×107CFU/g，然后均匀地喷洒到饲料上。将制备好的饲料放置于4 ℃冰箱，7 d内暂存备用。

1.3 澳洲淡水龙虾养殖管理

澳洲淡水龙虾养殖试验于室内养殖箱中进行，水温为26～30 ℃、pH值为7.0～7.3、持续曝气增氧的环境下溶解氧(DO)>6 mg·L-1，其他水质指标维持在澳洲淡水龙虾适宜的养殖范围内，暂养驯化3 d。挑选规格均匀[平均体重(25.0±2.5)g]、肢体完整、无外表病症、活力好的个体进行养殖试验。试验设置5组，分别是添加柠檬酸(S-Ⅰ)、复合酶制剂(S-Ⅱ)、植物乳杆菌加枯草芽孢杆菌(S-Ⅲ)、根瘤菌加枯草芽孢杆菌(S-Ⅳ)处理组和不添加任何物质的基础饲料对照组(S-CK)，每组设置3个平行。养殖箱规格为 530 cm×380 cm×290 cm，水深15～20 cm。每个养殖箱养殖20尾虾，并放置6个瓦片作为遮蔽物。每日投喂饲料2次，早上8点和下午5点，每日的投喂量约为虾体质量的6%，次日清除残饵和粪便，每日换水1次，每次换水1/3，饲养试验周期为14 d。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 酶活力

将活虾置于冰盘内无菌的玻璃平皿上解剖，用灭菌的镊子取出澳洲淡水龙虾肝胰腺，用滤纸吸干表面水分后称重，迅速放入预冷的1.5 mL离心管中，加入9倍体积预冷的生理盐水(0.86% NaCl)，利用手持均质器S-18KS 电动组织匀浆器(北京晨曦勇创科技有限公司)对在冰浴中的样品进行匀浆(工作时间为10 s/次，间歇30 s，连续3～5次)，然后用台式高速冷冻离心机(德国 Hettich UNIVERSAL 320R)10 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液作为待测肝胰腺悬液。每尾虾的肝胰腺悬液作为一个单独样本进行酶活力测定。消化酶指标包括胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，免疫相关指标包括超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)、总抗氧化能力(T-AOC)，上述指标均采用南京建成检测试剂盒测定。

1.4.2 离体消化率

肝胰脏取出后称重(方法同1.4.1酶活力)，迅速加入肝胰脏质量10倍体积(W/V)、预冷好的0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液(温度4 ℃，pH值7.4)，用手持均质器S-18KS 电动组织匀浆器在冰浴中进行匀浆，并以5 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液作为粗酶液。准确称取过80目筛的饲料样品各0.200 0 g，放入50 mL高温灭菌好的离心管中，加入0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液15 mL，分别加入不同处理组的消化酶液5 mL。在28 ℃生化培养箱中培养，在50 r/min摇床中振摇酶解，酶解时间为12 h。在4 000 r/min离心20 min，取上清液，用苏州科铭生物技术有限公司提供的试剂盒测定氨基酸含量。在离心管剩余残渣中加入15 mL蒸馏水，4 000 r/min离心去除上清液，重复洗涤2～3次。105 ℃烘干残渣至恒重，称重。参照刘襄河等[34]的实验方法，用凯氏定氮法测定饲料原料及其消化后相应残渣的蛋白质含量，并测定各组残渣干物质含量。饲料的干物质、蛋白消化率和总氨基酸转化效率按式(1)～式(3)计算。

干物质消化率(%)=(饲料样品重量-残渣样品重量)/饲料样品重量×100

(1)

蛋白质消化率(%)=(饲料样品重量×样品粗蛋白含量-残渣样品重量×残渣粗蛋白含量)/(饲料样品重量×样品粗蛋白含量)×100

(2)

总氨基酸转化效率(%)=生成的氨基酸总量/饲料样品重量×100

(3)

1.5 数据统计与分析

实验数据均以平均值±标准差表示。所有数据采用Excel和SPSS 18.0软件进行计算处理。各处理组间显著性分析采用单因素方差分析(One-way ANOVA) ，再进行 Duncan 多重比较分析，显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 非营养性饲料添加剂对澳洲淡水龙虾肝胰腺消化酶活力的影响

由表1可知，4种非营养性饲料添加剂对澳洲淡水龙虾肝胰腺胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力的影响均不相同。与S-CK组相比，S-Ⅰ组胰蛋白酶活力降低但差异不显著(P>0.05)，而S-Ⅱ组、S-Ⅲ组和S-Ⅳ组胰蛋白酶活力显著提高(P<0.05)；S-Ⅳ组胰蛋白酶活力均值最高，为(7 514.87±663.40)U/mgprot，显著高于S-CK组227.7%(P<0.05)。在对澳洲淡水龙虾的脂肪酶影响中，与S-CK组相比，S-Ⅰ组和S-Ⅱ组的活力均无差异显著(P>0.05)，但S-Ⅲ组和S-Ⅳ组脂肪酶活力差异显著(P<0.05)，且S-Ⅲ组活力均值最高，为(17.60± 0.59)U/g，显著高于S-CK组9.8%(P<0.05)。在对澳洲淡水龙虾的淀粉酶活力影响中，S-Ⅰ组和S-Ⅱ组的活力显著高于S-CK组(P<0.05)；S-Ⅱ组活力均值最高，为(0.159±0.007 2)U/mgprot，显著高于S-CK组368.7%(P<0.05)。S-Ⅲ组和S-Ⅳ组的淀粉酶活力也分别显著高于S-CK组270.7%、241.3%(P<0.05)。说明这4种非营养性饲料添加剂均可提高澳洲淡水龙虾肝胰腺消化酶的活力。

表1 四种非营养性饲料添加剂对澳洲淡水龙虾肝胰腺消化酶活力的影响Tab.1 Effects of four non-nutritive supplemental diets on activities of digestive enzyme in hepatopancreas of C.quadricarinatus

2.2 非营养性饲料添加剂对澳洲淡水龙虾免疫功能的影响

表2为各试验组对澳洲淡水龙虾免疫功能的影响结果。从表2可知，与S-CK组相比，S-Ⅱ组澳洲淡水龙虾的ACP活力显著降低(P<0.05)，但与其他处理组均差异不显著(P>0.05)。在4种非营养性饲料添加剂对澳洲淡水龙虾AKP的影响中，所有实验组AKP的活力均差异不显著(P>0.05)，这可能与处理组养殖时间较短有关。在对澳洲淡水龙虾SOD影响中，4种非营养性饲料添加剂处理组的SOD活力依次显著高于S-CK组1.53%、1.22%、22.79%和38.45%(P>0.05)。在对澳洲淡水龙虾T-AOC影响中，与S-CK组相比，S-Ⅰ组的T-AOC虽有提高但差异不显著(P>0.05)，但S-Ⅱ组、S-Ⅲ组和S-Ⅳ组分别显著提高了94.21%、95.99%和127.09%(P<0.05)。其中S-Ⅳ组的SOD活力和T-AOC均值最高，分别为(3.593±0.076)、(7.116±0.588)U/mgprot。从表2分析可知，以各试验组澳洲淡水龙虾的T-AOC排序为：S-Ⅳ组>S-Ⅲ组>S-Ⅰ组>S-Ⅱ组>S-CK组。

表2 四种非营养性添加饲料对澳洲淡水龙虾免疫相关酶活力的影响

2.3 澳洲淡水龙虾对非营养性饲料添加剂的离体消化率的影响

澳洲淡水龙虾肝胰腺提取的粗酶液对非营养性饲料添加剂的离体消化率见表3。与S-CK组相比，各处理组的干物质消化率、蛋白质离体消化率和总氨基酸转化效率都有明显的提高。其中S-Ⅰ组和S-Ⅱ组的干物质消化率分别比S-CK组提高5.5%和3.6%，但差异不显著(P>0.05)；S-Ⅲ组和S-Ⅳ组分别比S-CK组显著提高11.6%和14.3%(P<0.05)。S-Ⅰ组和S-Ⅲ组的蛋白质离体消化率分别较S-CK组提高7.8%和21.6%，但差异不显著(P>0.05)；而S-Ⅱ组和S-Ⅳ组与S-CK组相比，分别显著提高26.9%和32.9%(P<0.05)。与S-CK组比，S-Ⅰ组总氨基酸转化效率提高了6.5%，但差异不显著(P>0.05)；而S-Ⅱ组、S-Ⅲ组和S-Ⅳ组的总氨基酸转化效率分别显著提高了8.2%、46.8%和64.2%(P<0.05)。S-Ⅳ组的干物质消化率、蛋白质离体消化率和总氨基酸转化效率均最高。

表3 澳洲淡水龙虾肝胰腺对四种非营养性添加饲料的离体消化率

3 讨论

3.1 非营养性饲料添加剂对澳洲淡水龙虾消化酶活力的影响

肝胰脏在虾类器官中发挥重要的消化酶分泌作用，其中消化酶活力的大小是衡量虾类消化能力的重要指标[35]。目前在水产动物的研究方面，潘庆等[36]研究的结果显示，在饲料中添加0.2%柠檬酸可以提高奥尼罗非鱼(Oreochromisniloticus×O.aureus)蛋白酶、胰蛋白酶和肠蛋白酶活力。柠檬酸的金属离子配位性良好，可改善消化道的某些部位产生的酸性环境，从而提高对矿物质盐的溶解性和吸收率[37]。柠檬酸可提高虹鳟(Oncorhynchusmykiss)体内灰分、磷和铁的含量[38]。本研究结果同样发现，饲料中添加0.2%柠檬酸对澳洲淡水龙虾的淀粉酶活性有显著影响(P<0.05)。水产饲料添加复合酶，一方面可以补充水产动物内源性消化酶的不足，另一方面可以促进水产动物对饲料的消化利用。蔡永祥等[39]研究发现，外源性复合酶的添加可显著提高日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)蛋白酶的活性(P<0.05)，而对淀粉酶活性影响较小。王国霞等[40]发现在南美白对虾中添加不同的单酶，对其蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶均无显著性影响(P>0.05)。本试验研究结果表明，添加0.2%复合酶可以显著提高澳洲淡水龙虾的胰蛋白酶和淀粉酶活性(P<0.05)，但对其脂肪酶活性影响不显著(P>0.05)。上述研究结果存在一定的差异，这可能与选取虾的品种、试验条件以及养殖方式有关。芽孢杆菌能促进水生动物生长，与其可促进消化、提高营养物质利用率有关。丁贤等[41]在饲料中添加芽抱杆菌制剂养殖凡纳滨对虾，发现实验组的蛋白酶活性明显高于对照组，且消化酶活性和成活率均明显提高。芽孢杆菌还可以显著提高印度明对虾(Fenneropenaeusindicus)幼虾的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性(P<0.05)[42]。利用添加枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的饲料饲养尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)7 d可改善其肠道微生物群分布，并提高淀粉酶活性[43]。廖竹等[44]研究发现，在饲料中添加植物乳杆菌加枯草芽孢杆菌混合菌的仔猪生长性能、血清生化指标和抗氧化能力比添加单一菌的效果好。本试验研究结果与上述研究结果相同，饲料中添加植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌、养殖14 d可以显著提高澳洲淡水龙虾肝胰腺的胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性(P<0.05)。管振国[45]研究发现，在饲料中添加根瘤菌，可改善凡纳滨对虾肠道的健康状况，促进营养物质的消化吸收，而且其肝胰腺中脂肪酶的活性也显著提高(P<0.05)，这与本试验研究结果一致。本试验证实，饲料中添加根瘤菌和枯草芽孢杆菌有利于显著提高澳洲淡水龙虾肝胰腺的蛋白酶和淀粉酶活性(P<0.05)。

3.2 非营养性饲料添加剂对澳洲淡水龙虾免疫功能的影响

本试验研究了饲料中添加4种非营养性物质对澳洲淡水龙虾肝胰腺中ACP、AKP、SOD活性和T-AOC的影响。这几种酶在甲壳动物非特异性免疫中发挥着重要作用，其中ACP和AKP负责水解水生动物中的有机磷。ACP参与调控磷酸基团的转移和代谢，提高物质的摄入和转运；与其他酶类形成吞噬细胞，破坏并清除侵入体内的异物[46]。AKP与甲壳动物对钙、磷的吸收及甲壳素的生成和分泌直接关联，并与其他水解酶类形成重要的解毒体系，在非特异免疫中发挥着重要作用[47]。SOD是机体内的抗氧化酶，可以清除超氧自由基、防止生物分子损伤，对组织的氧化胁迫起到重要防御和保护作用[48]。T-AOC反映机体总体抗氧化活力的重要指标，可以更全面地体现机体的抗氧化防御水平[21]。程卓等[16]研究显示，在饲料里添加柠檬酸对草鱼(Ctenopharyngodonidella)血清AKP活性无显著影响(P>0.05)。蔡永祥等[39]研究发现，日本沼虾血清中ACP和AKP活性以饲料中添加复合酶的最高，显著高于其他组(P<0.05)。这与本试验研究结果不一致，本研究试验结果显示，4种非营养性饲料添加剂养殖澳洲淡水龙虾14 d后，其肝胰腺的ACP和AKP活性影响差异不显著(P>0.05)。原因一方面是这4种非营养性饲料添加剂进入虾肠道后，会调节机体肠道酸碱度和微生物菌群结构，争夺黏附位点，可能会干扰到澳洲淡水龙虾体内原有的益生菌的作用模式[41]。另一方面，14 d的养殖可能不足以引起澳洲淡水龙虾ACP和AKP活性的积极生理变化。王守全[49]研究显示，在试验第 45 d，枯草芽孢杆菌组的凡纳滨对虾的SOD活性显著高于基础饲料组(P<0.05)。管振国等[28]研究发现，饲料添加根瘤菌对凡纳滨对虾血清和肝胰腺中 SOD和AKP 的活力较对照组均有所提高。李军亮等[50]在低鱼粉饲料中添加枯草芽孢杆菌，发现凡纳滨对虾血清的SOD和AKP均显著高于对照组(P<0.05)。郑玉等[24]试验表明融合乳杆菌和植物乳杆菌也可提高凡纳滨对虾血清T-AOC及ACP、AKP活性。本试验同样发现，不同处理组的SOD活性与T-AOC均比对照组高；其中饲料添加根瘤菌加枯草芽孢杆菌处理组的SOD活力与T-AOC均值最高，且SOD活性显著高于添加植物乳杆菌加枯草芽孢杆菌处理组，T-AOC在两个处理组之间差异不显著(P>0.05)。说明饲料添加益生菌可提高澳洲淡水龙虾的抗氧化酶活性，其中添加根瘤菌加枯草芽孢杆菌效果最佳。

3.3 澳洲淡水龙虾对非营养性饲料添加剂的离体消化率的影响

离体消化法是通过在体外利用酶制剂或研究对象消化器官的酶提取液在试管内模拟试验动物的消化过程，对原料进行水解消化，其测定值近似反映对原料的消化率。程卓等[16]发现饲料中添加0.3%柠檬酸能提高草鱼的生长性能和饲料利用率。窦勇等[51]研究发现，膨化饲料添加复合酶制剂可有效提高黄颡鱼(Tachysurusfulvidraco)的营养物质表观消化率，并提高黄颡鱼生长性能。於叶兵等[52]在斑节对虾饲料中添加芽孢杆菌，发现添加量3.0 g/kg可以显著地提高干物质、氨基酸和粗蛋白表观消化率。在赖凯昭[53]研究中，饲料里添加适量的含有芽孢杆菌和乳酸菌等复合益生菌能显著提高罗非鱼对饲料营养的消化吸收率。本研究试验结果同样显示，4种非营养性饲料添加剂均可改善澳洲淡水龙虾的离体消化率。另外本试验研究发现，与对照组相比，饲料中添加0.2%柠檬酸或0.2%复合酶均可以提高澳洲淡水龙虾的干物质消化率和总氨基酸转化效率，但差异不显著(P>0.05)。饲料中添加植物乳杆菌加枯草芽孢杆菌或根瘤菌加枯草芽孢杆菌可以显著提澳洲淡水龙虾的干物质消化率、蛋白质离体消化率和总氨基酸转化效率，其中根瘤菌加枯草芽孢杆菌处理组均值最高，植物乳杆菌加枯草芽孢杆菌处理组次之。说明饲料中添加益生菌处理组的消化能力比添加柠檬酸或复合酶处理组的强。这4种非营养性饲料添加剂中最适合澳洲淡水龙虾的是根瘤菌加枯草芽孢杆菌，其次是植物乳杆菌加枯草芽孢杆菌。

4 结论

利用4种非营养性饲料添加剂养殖澳洲淡水龙虾14 d后，其肝胰腺消化酶活力、免疫功能及离体消化率呈现不同程度的差异性。添加植物乳杆菌加枯草芽孢杆菌、根瘤菌加枯草芽孢杆菌处理组的消化酶活力、免疫功能及离体消化率的影响比添加柠檬酸或复合酶的高，并且添加根瘤菌加枯草芽孢杆菌的离体消化率比添加植物乳杆菌加枯草芽孢杆菌的高，因此在选择非营养性添加剂时，优先选择根瘤菌加枯草芽孢杆菌。