氨海水和5-羟色胺对菲律宾蛤仔解剖配子体外促熟的影响

巫旗生，祁剑飞，罗 娟，宁 岳，郭 香，罗辉玉，曾志南

(福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心，福建 厦门 361013)

菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)隶属软体动物门、双壳纲、帘蛤科，为我国四大海水养殖贝类之一[1]，具有养殖方式简单、周期短、投资少、效益高等优点。2021 年中国蛤类产量达 428.98 ×104t，占中国海水养殖总产量的 19.40%[2]，其中菲律宾蛤仔产量超过300×104t，位居世界首位。菲律宾蛤仔是福建省重要的海水养殖贝类品种之一，目前其养殖规模和产量在福建省仅次于牡蛎，位居第二位。福建是中国菲律宾蛤仔苗种最主要的生产和供应基地，占全国苗种产量的90%以上[2]，苗种生产方式主要为垦区大水面人工育苗[3-5]和工厂化人工育苗[6-9]。福建菲律宾蛤仔苗种除满足中国需求外，还远销东南亚等沿海国家。

在海水贝类人工繁育过程中，配子的质量直接影响到受精率、孵化率以及幼虫的生长速度、存活率、附着变态等[10]。大部分海水贝类解剖获得的配子需要采用化学药物[维生素、氨海水、5-羟色胺(5-HT)、多巴胺、组胺等]进行激活或促熟(生发泡破裂)，从而使受精卵发育至幼虫[11]。王昭萍等[12]采用维生素浸泡太平洋牡蛎(Crassostreagigas)卵子，促进了成熟度较差的卵子进一步成熟，从而提高卵子的受精率。邓海姣[10]和李浩浩等[13]采用了不同浓度的氨海水处理栉江珧(Atrinapectinata)的解剖配子，结果表明一定浓度范围内的氨海水浸泡可以促使卵子成熟及激活精子，提高卵子的受精率，而5-HT、多巴胺和维生素对栉江珧解剖卵子的促熟效果不明显。邸炜鹏等[14]对栉孔扇贝(Chlamysfarrer)解剖卵子进行了体外促熟研究，结果表明一定浓度的氨海水可显著促使卵子生发泡破裂，但受精率不高；5-HT不能诱导卵子生发泡破裂，但能促使生发泡破裂的卵子进一步成熟；先用氨海水处理，再用5-HT处理，可以得到最佳诱导效果。本研究采用氨海水和5-HT对菲律宾蛤仔的解剖配子进行体外促熟，统计卵子的生发泡破裂发生率和受精率，观察受精卵胚胎发育情况，明确氨海水和和5-HT处理菲律宾蛤仔配子的适宜浓度范围，为菲律宾蛤仔的选择育种及多倍体育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 配子的获得

实验用菲律宾蛤仔为福建省宝智水产科技有限公司土池养殖的1龄亲贝，平均体质量为(12.13±2.08)g，平均壳长为(3.88±0.29)cm，平均壳高为(2.66±0.28)cm，平均壳宽为(1.78±0.22)cm。将土池促熟后的菲律宾蛤仔解剖，从中选择性腺饱满的雌雄个体，分别挤出卵、精。精子：采用400目筛绢网过滤杂质，获取精液；卵子：先用250目筛绢网过滤大颗粒组织等，再用400目筛绢网过滤黏液等。镜检配子的成熟度，选择发育成熟的配子开展体外促熟实验。

1.2 解剖配子的体外促熟

在实验室恒温(25 ℃)条件下，分别取50 mL卵液或20 mL精液加入100 mL烧杯中，再添加不同浓度的氨海水处理液或5-HT处理液，卵子密度为100～500个/mL，摇匀后开始计时。氨海水处理液的浓度梯度设置为0.002 5%、0.005%、0.010%、0.015%、0.020%和0.025%，5-HT处理液的浓度梯度设置为0.01、0.1、1、10、100、1 000 μmol/L，处理时间梯度为15、30、45、60 min。以自然海水处理的配子作为对照，每个实验组设置3个平行。

1.3 人工授精

采用400目筛绢网过滤去除氨海水处理液或5-HT处理液，将收集到的卵子放入100 mL烧杯中，先加入50 mL自然海水，再加入适量精子，确保一个卵子周围有5～10个精子，充分摇匀。在受精过程中，需要经常搅动受精卵液，增加水体溶解氧含量。

1.4 观察记录生发泡破裂发生率和受精率

受精卵胚胎发育1 h后，使用显微镜观察记录并计算卵子的生发泡破裂发生率和受精率。

生发泡破裂发生率=生发泡破裂的卵子数量/卵子总数×100%

(1)

受精率=卵裂的受精卵数量/卵子总数×100%

(2)

1.5 数据处理

获得的实验组数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，利用多重比较检验不同实验组间差异的显著性，显著水平设置为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 菲律宾蛤仔精子体外激活及卵子体外促熟的过程

采用自然海水或5-HT处理液浸泡均不能激活菲律宾蛤仔解剖精子，0.010%～0.025%氨海水可以有效激活解剖精子。菲律宾蛤仔解剖卵子经过自然海水的浸泡，生发泡不会发生破裂(图1A)；采用5-HT处理液或氨海水处理液浸泡菲律宾蛤仔的卵子后，生发泡发生破裂(图1B)；菲律宾蛤仔的卵子经过体外促熟后受精，一部分受精卵可以进行正常的胚胎发育(图1C)；一部分受精卵出现胚胎发育缓慢及畸形等现象(图1D)。

2.2 5-HT对菲律宾蛤仔卵子的促熟作用

采用5-HT处理液浸泡可以显著促使菲律宾蛤仔卵子的成熟(图2)，随着处理时间的延长，生发泡破裂发生率均显著升高(P<0.05)，表现出时间依赖关系。当处理时间相同时，采用0.01～ 0.1 μmol/L 5-HT处理液浸泡菲律宾蛤仔卵子，生发泡破裂发生率差异不显著(P>0.05)；当采用1 μmol/L～1 mmol/L 5-HT处理液浸泡菲律宾蛤仔卵子，生发泡破裂发生率差异显著(P<0.05)，表现出浓度依赖关系。当采用 1 mmol/L 5-HT处理液浸泡菲律宾蛤仔卵子60 min时，生发泡破裂发生率最高，达79.31%。

注：同一时间点标有不同小写字母表示组间有显著性差异 (P<0.05)；标有相同小写字母者表示组间无显著性差异 (P>0.05)。下同。

菲律宾蛤仔卵子经过不同浓度的5-HT处理液浸泡后进行人工授精，随着受精时间的延长，受精率均显著升高(P<0.05)，表现出时间依赖关系(图3)。当处理时间相同时，表现出一定的浓度依赖关系，10～100 μmol/L 5-HT处理组的卵子受精率显著高于其他处理组(P<0.05)。其中，采用10 μmol/L 5-HT处理液浸泡菲律宾蛤仔卵子60 min获得的受精率最高，为28.38%。

2.3 氨海水对菲律宾蛤仔卵子的促熟作用

采用氨海水处理液浸泡可以显著促使菲律宾蛤仔卵子的成熟(图4)，随着处理时间的延长，生发泡破裂发生率均显著升高(P<0.05)，表现出时间依赖关系。当处理时间分别为45、60 min时，生发泡破裂发生率随浓度增加而显著升高(P<0.05)，表现出浓度依赖关系。当采用0.025%氨海水处理液浸泡菲律宾蛤仔卵子60 min时，生发泡破裂发生率最高，达80.01%。

菲律宾蛤仔卵子经过不同浓度的氨海水处理液浸泡后进行人工授精，随着受精时间的延长，受精率均显著升高(P<0.05)，表现出时间依赖关系(图5)。当不同浓度氨海水处理组的处理时间相同时，受精率表现出浓度依赖关系。0.010%～0.015%氨海水处理组的卵子受精率显著高于其他处理组(P<0.05)，其中0.015%氨海水处理浸泡60 min的卵子的受精率最高，达到41.28%。

采用不同浓度的氨海水处理液浸泡菲律宾蛤仔卵子可以显著提高生发泡破裂发生率及受精率，但氨海水的毒性作用会导致受精卵的畸形率较高，其中一部分受精卵在胚胎发育过程中停滞。

3 讨论

3.1 5-HT对海水贝类配子的体外促熟作用

5-HT是一种存在于动物神经系统中的神经递质，通过相关受体调节生物体多种复杂行为[15]。Dahl E等[16]首次在双壳类的神经系统和性腺组织中发现5-HT。5-HT在海水贝类繁殖过程中起到重要作用，既可以促进海水贝类产卵、排精，也可以促使海水贝类解剖卵子成熟等[17]。Hamida L等[18]研究表明5-HT可以促进沟纹蛤仔(Ruditapesdecussatus)卵子的成熟和排放；王清等[19]也证明了5-HT对硬壳蛤(Mercenariamercenaria)卵子具有体外促熟作用。

本研究采用5-HT处理液浸泡菲律宾蛤仔的解剖卵子，表明5-HT可以有效促使卵子的生发泡破裂，生发泡破裂发生率最高达到79.31%；采用10 μmol/L 5-HT处理液浸泡卵子60 min的受精率最高，达到28.38%。这与栉孔扇贝[14]、硬壳蛤[20]等的研究结果相似，高于栉江珧[10]，低于钝缀锦蛤(Tapesconspersus)[21]。这可能与卵子发育成熟度不一致有关，也可能是种间差异造成的。

3.2 氨海水对海水贝类配子的体外促熟作用

在海水贝类人工繁育过程中，采用氨海水等化学药品浸泡诱导海水双壳贝壳在排放精、卵以及促进配子成熟等方面发挥着重要作用[22]。氨海水处理液呈弱碱性，NH4OH提高了海水pH，同时增加了配子细胞膜的通透性，促进了配子物质和能量的代谢，从而达到促熟配子的目的[23]。喻达辉等[24]认为氨海水处理液对合浦珠母贝(Pinctadamartensii)精子起激活作用的主要成分是NH4+。方永强[25]认为氨海水处理液对菲律宾蛤仔卵子起促熟作用的主要原理是通过促进细胞核和细胞器的物质和能量代谢来起到促熟作用。

不同浓度的氨海水及不同处理时间可以显著影响海水贝类卵子的生发泡破裂发生率、受精率和畸形率[26]。李浩浩等[13]采用0.008%～0.014%氨海水处理栉江珧的解剖卵子，当浸泡40 min时，生发泡破裂发生率为90%，受精率最高达到88%。邸炜鹏等[14]采用0.005%氨海水处理栉孔扇贝的解剖卵子，当浸泡30 min时，生发泡破裂发生率为100%，受精率最高达到15.88%。巫旗生等[21]采用0.020%氨海水处理钝缀锦蛤的解剖卵子，当浸泡45 min时，生发泡破裂发生率为60.76%，受精率最高达到50.75%。本研究结果表明，采用0.015%氨海水处理菲律宾蛤仔的解剖卵子，当浸泡60 min时，生发泡破裂发生率为66.67%，受精率最高达到41.28%。采用氨海水浸泡解剖卵子可以取得较好的受精率，但是受精卵在胚胎发育过程中容易出现畸形、发育迟缓等现象。因此，在实际生产中，应控制好氨海水的浓度以及处理时间，从而确保较高的受精率及较低的畸形率。