miR-361-3P调控转化生长因子β1诱导成骨细胞凋亡的研究

王帆，王鹏皓

（中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳 110001）

人体骨骼的正常代谢依靠成骨细胞与破骨细胞的动态平衡维持。这种动态平衡受骨组织周围微环境中存在的多种细胞因子调节，其中，转化生长因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1） 作为骨组织局部微环境中至关重要的调节因子，在成骨活动中发挥十分重要的作用［1］。细胞凋亡使细胞在基因控制下程序性死亡，进而维持体内细胞数量动态平衡，影响组织周围内环境相对稳定。研究［2］证明，微RNA （micro RNA，miRNA） 对成骨细胞的再生、转化、分化等代谢过程起至关重要的作用。目前对miR-361-3P在骨代谢相关疾病中的研究较少见，且其对成骨细胞自我程序性死亡的作用机制尚未清楚。因此，本研究拟通过分子生物学技术检测人成骨细胞内miR-361-3P对TGF-β1和细胞凋亡标志分子caspase 3蛋白活性表达的影响，以探讨miR-361-3P/TGF-β1通路在人成骨细胞凋亡中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

用DMEM培养液 （含10 % 胎牛血清、300 mg/L G418） 于37 ℃、5% CO2培养箱中培养人成骨细胞系hFob1.19 （北京307-青藤转化医学中心）。

1.2 细胞分组及转染

miR-361-3p mimic （mimic）、miR-361-3p inhibitor（inhibitor） 和 TGF-β1 siRNA （si-TGF-β1） 均购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。将hFob1.19细胞随机分为control组、mimic组及其阴性对照组 （mimic-NC组）、inhibitor 组及其阴性对照组 （inhibitor-NC组）、si-TGF-β1及其阴性对照组 （si-NC组）。采用Lipofectamine 2000脂质体转染系统 （北京中杉金桥生物有限公司），于37 ℃、5% CO2、95%湿度条件下行细胞转染8 h。

1.3 CCK-8实验

将hFob1.19细胞转移至6孔板，培养48 h，每孔加入10 μL CCK-8 （5 mg/mL，北京中杉金桥生物有限公司），孵育2 h，450 nm 处检测吸光度。

1.4 实时PCR （real-time quantitative PCR，RT-qPCR）

用TRIzol试剂提取细胞总RNA。采用Nanodrop 2000测定RNA样品的浓度和纯度。用primematipt混合RT 随机引物对mRNA行逆转录。用TRIzol reagent行miRNA逆转录。……