肺结核患儿外周血单个核细胞miRNA-31、miRNA-146a表达水平检测价值

宋 煜,王雅楠,徐 於,王聿佳,熊 英△

陕西省康复医院:1.检验科;2.儿科,陕西西安 710065

肺结核(PTB)是由结核分枝杆菌感染人体肺部引起的一种慢性传染病,病情严重时可导致人死亡,是威胁人类生命健康安全的重大公共卫生问题之一[1]。相关调查数据显示,儿童PTB在所有PTB患者中比例为10%,且儿童存在不同于成年人的发病特点,包括免疫学发病机制、临床症状及预后转归等[2]。由于儿童PTB临床表现普遍不典型,且目前诊断技术有限,难以实现早期准确诊断,易导致病情延误,不利于患儿预后[3]。因此,寻找一种新型的标志物进行PTB早期诊断成为亟待解决的难题。微小核糖核酸(miRNA)是近年来发现的一类非编码单链内源性小分子RNA,主要通过与相关碱基配对来调节靶基因或(和)调控蛋白表达,进一步参与疾病的发生、发展过程[4]。目前,国内外已有不少关于miRNA和PTB的研究[5-6],但主要集中在成人PTB中,关于儿童PTB和miRNA的关系研究鲜见报道。鉴于此,本研究通过分析PTB儿童外周血单个核细胞(PBMC)miRNA-31、miRNA-146a表达水平,以及上述指标与免疫细胞和炎症因子的相关性,以期为儿童PTB的诊断和治疗提供新的靶点和思路,现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2019年2月至2022年2月收治的75例PTB患儿作为观察组,其中男45例,女30例;年龄3～12岁,平均(6.12±1.30)岁。另选取本院同期健康体检的70例儿童作为对照组,其中男42例,女28例;年龄3～12岁,平均(6.09±1.32)岁。两组年龄、性别比较,差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准:(1)观察组所有患儿均符合《儿童肺结核的临床诊断标准和治疗方案(试行)》[7]中的诊断标准,对照组儿童体检各项指标和检查结果均无异常;(2)年龄≤12岁;(3)入组前未接受相关治疗;(4)临床资料完整。排除标准:(1)神志异常;(2)合并重要脏器疾病;(3)伴有重大感染或免疫性疾病。所有研究对象监护人均知情本研究,并签署知情同意书。本研究经本院医学伦理委员会审核批准。

1.2方法 (1)PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平检测:采用无菌肝素抗凝真空采血管采集所有儿童静脉血3 mL,以密度梯度离心法分离PBMC。采用Trizol法提取标本总RNA,遵循miRNA反转录试剂盒(购自北京Invitrogen公司)获取cDNA保存至—80℃冰箱中备用,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平。miRNA-31引物序列如下:上游引物为5′-GCCGCAGGCAGATGCTG-3′;下游引物为5′-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3′。miRNA-146a引物序列如下:上游引物为5′-CATGATTGTATGACTGCACTC-3′;下游引物为5′-TCTTGCTAGGACTGACCA-3′。以U6作为miRNA内参,上游引物为5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′;下游引物为5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。采用2-ΔΔCt法计算miRNA-31、miRNA-146a表达水平。(2)免疫细胞检测:采用FCM型流式细胞仪(购自常州必达科生物科技有限公司)检测T淋巴细胞亚群,指标包括CD3+、CD4+、CD8+比例,并计算CD4+/CD8+比值。相关抗体均购自金斯瑞生物科技股份有限公司。(3)炎症因子检测:抽取所有受试者空腹静脉血3 mL,离心半径8 cm,3 500 r/min离心10 min获取血清,采用酶联免疫吸附试验检测白细胞介素(IL)-2、IL-6、IL-8水平。所有操作均按照试剂盒说明书进行,试剂盒均购自深圳晶美生物科技有限公司。

1.3观察指标 比较两组PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平,以及T淋巴细胞亚群、炎症因子水平;分析PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平与T淋巴细胞亚群、炎症因子的相关性,评估PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平单独及联合检测诊断儿童PTB的效能。

2 结 果

2.1两组PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平比较 与对照组比较,观察组PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平比较

2.2两组T淋巴细胞亚群水平比较 与对照组比较,观察组CD3+比例、CD4+比例、CD4+/CD8+比值均降低,而CD8+比例升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组T淋巴细胞亚群水平比较

2.3两组炎症因子水平比较 与对照组比较,观察组IL-2、IL-6及IL-8水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组炎症因子水平比较

2.4PTB患儿PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平与T淋巴细胞亚群、炎症因子水平的相关性分析 Pearson相关分析发现,PTB患儿PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平与CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值均呈负相关(P<0.05),与CD8+比例及IL-2、IL-6、IL-8水平均呈正相关(P<0.05)。见表4。

表4 PTB患儿PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平与T淋巴细胞亚群、炎症因子的相关性分析

2.5PTB患儿PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平检测诊断儿童PTB的效能 ROC曲线分析结果显示,PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平联合检测诊断儿童PTB的曲线下面积(AUC)均大于单项检测,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5、图1。

图1 PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平检测诊断儿童PTB的ROC曲线

表5 PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平检测诊断儿童PTB的效能

3 讨 论

结核病为常见的慢性传染病之一,伴随着病情的日益进展,可累及多个器官,且以PTB最多见,患者往往存在严重的肺组织损伤,进而导致肺功能降低,严重威胁健康及生命[8-10]。因此,早期实现有效诊断与及时治疗PTB是国内外研究的热点。miRNA不但扮演细胞内基因调控网络关键分子的角色,亦是多种病理状态下的重要生物标志物。近年来,已有不少研究报道证实,血液循环中的多种miRNA均可作为肺癌及肺炎等疾病的生物标志物[11-13]。血清中PBMC或PBMC中的miRNA检测为疾病诊断、疗效评估及个性化治疗均提供了操作简便的无创性检测手段。因此,本研究通过分析儿童PTB PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平,以及上述指标与T淋巴细胞亚群和炎症因子的相关性,对儿童PTB的诊断价值,旨在为上述两项指标作为儿童PTB的临床诊断标志物提供理论依据。

本研究结果表明,观察组PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平明显高于对照组,这提示儿童PTB PBMC miRNA-31、miRNA-146a均存在异常高表达。可能是由于miRNA-31主要介导Janus激酶/信号与转录激活子(JAK/STAT)及丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等多种结核感染有关信号通路,并通过对上述相关信号通路活性的调控,进一步抑制机体的免疫应答,最终引发结核分枝杆菌的感染[14]。miRNA-146a高表达会提升巨噬细胞对细胞内结核分枝杆菌的灭杀能力,进而抑制该致病菌的生长、繁殖,是机体应对结核分枝杆菌感染时的自然应答[15]。ROC曲线分析结果显示,PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平联合检测诊断儿童PTB的AUC均高于单项检测,差异均有统计学意义(P<0.05),提示临床工作中可通过对上述两项指标表达水平进行联合检测实现对儿童PTB的辅助诊断。此外,与对照组比较,观察组CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值均降低,而CD8+比例升高,差异均有统计学意义(P<0.05),提示结核免疫属于细胞免疫,主要是由单核巨噬细胞介导的复杂免疫应答过程,而CD3+、CD4+、CD8+比例及CD4+/CD8+比值均是细胞免疫的重要指标。而PTB的发生会对患儿肺组织产生一定的损伤,进而影响免疫应答,最终导致上述指标的异常表达[16]。另外,与对照组比较,观察组IL-2、IL-6及IL-8水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05),提示IL-2、IL-6及IL-8均是临床上应用较为广泛的炎症因子,在机体出现创伤、感染等状况时,其在血清中水平急剧升高,可能对儿童PTB具有一定的辅助诊断作用。PTB患儿因肺组织遭受不同程度的损伤,进而导致上述指标出现应激性升高,并参与疾病的进展过程[17]。此外,Pearson相关分析发现,PTB患儿PBMC miRNA-31、miRNA-146a表达水平与CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值水平均呈负相关(P<0.05),与CD8+、IL-2、IL-6、IL-8水平均呈正相关(P<0.05)。说明miRNA-31、miRNA-146a可能是通过靶向调控MAPK及JAK/STAT等信号通路,从而发挥炎症免疫调控作用,进而参与PTB的发生、发展。

综上所述,儿童PTB PBMC miRNA-31、miRNA-146a均存在明显高表达,且与细胞免疫、炎症因子均密切相关,可作为辅助诊断PTB的潜在生物学标志物,值得临床重点关注。