舒筋活血片中非法染色剂酸性红73的检测研究

巩长芹，郑振秋，李志娇，孙成考

（临沂市检验检测中心，山东 临沂 276001）

舒筋活血片为常用的中成药品种，收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十三册，目前执行标准有国家食品药品监督管理局标准[1]，处方由红花、醋香附、烫狗脊、香加皮、络石藤、伸筋草、泽兰叶、槲寄生、鸡血藤、煅自然铜组成；功效为舒筋活络，活血散瘀；主治筋骨疼痛，肢体拘挛，腰背酸痛，跌打损伤。方中红花近年应用广泛，由于来源有限，价格上涨，其掺伪造假情况较为严重，常有不法人员将其染色伪装，或以次品染色充当优品[2]。染色剂的加入严重影响疗效，危害人体健康[3-5]。如酸性红73又名酸性大红GR，为黄光红色粉末，是食品禁用色素，具有致癌性。红花掺伪染色的鉴别方法有较多文献报道，但中成药中染色剂的筛查却鲜有报道。本文用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）确认舒筋活血片中的非法染色剂酸性红73并采用HPLC定量测定，为打击中成药非法添加染色剂提供了技术手段。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AD/API4000+液质联用色谱仪（日本岛津/美国AB公司）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦）；XS205电子分析天平（美国梅特勒托利多）；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

酸性红73对照品（来源：中国食品药品检定研究院，批号：111773-201602）；乙腈（德国默克，色谱纯）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。46批舒筋活血片来自2020年山东省风险监测抽检样品。

2 方法与结果

2.1 HPLC排查

2.1.1 溶液的制备

2.1.1.1 对照品溶液的制备 精密称取酸性红73对照品11.78 mg，置50 ml量瓶中，加入70 %乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取酸性红73对照品储备液1 ml，置100 ml量瓶中，加70 %乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液I。

2.1.1.2 供试品溶液的制备 分别取舒筋活血片20片，包衣片除去包衣，研细，精密称取2.0 g，置具塞锥形瓶中，加70 %乙醇20 ml[6-10]，超声（功率300 W，频率40 kHz）20 min，滤过，滤液回收溶剂，置5 ml量瓶中，加70 %乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.1.1.3 阴性溶液的制备 未检出染色试剂的样品溶液即为阴性样品溶液。

2.1.2 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.05 mol/L乙酸铵溶液（B），按表1进行梯度洗脱，检测波长：515 nm；流速：0.8 ml/min；柱温：30 ℃。

表1 HPLC梯度洗脱程序

取2.1.1项下的供试品溶液、对照品溶液和阴性溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图1。

图1 对照品溶液（A）、供试品溶液（B）、阴性溶液（C）HPLC图谱

2.1.3 专属性试验

2.1.3.1 HPLC-DAD 取2.1.1项下供试品（检出酸性红73）溶液与对照品溶液进入液相色谱仪，比较190～700 nm波长范围内的紫外-可见吸收光谱，其光谱图基本一致，见图2。

图2 对照品溶液（A）和供试品（检出酸性红73）溶液（B）光谱图

2.1.3.2 HPLC-MS/MS 色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），按表2进行梯度洗脱；柱温：35 ℃；流速：0.3 ml/min；进样量：20 μl。

表2 HPLC-MS/MS 梯度洗脱程序

质谱采集参数：电喷雾负离子扫描模式（ESI-），气帘气（CUR）：35 psi，离子化电压（IS）：-4500 V，温度：350 ℃，喷雾气（GS1）：40 psi，辅助加热气（GS2）：40 psi，选择质荷比m/z255.0→150.3和m/z255.0→240.6为检测离子对，碰撞能量：-19 V，去簇电压（DP）：-60 V。

对照品溶液：取2.1.1项下对照品溶液I 0.2 ml，置200 ml量瓶中，加70 %乙醇稀释至刻度，作为对照品溶液II。

供试品溶液：取2.1.1项下供试品（检出酸性红73）溶液，用水稀释10倍，摇匀，作为供试品溶液。

阴性溶液：取2.1.1项下阴性溶液。

供试品溶液与对照品溶液二者的离子流色谱图一致，而阴性溶液未呈现与对照品溶液相同的离子流图。二级质谱图见图3。

图3 二级质谱图

2.1.4 样品排查结果 排查46批次舒筋活血片样品，有4批次呈阳性结果。

由排查结果可见，46批舒筋活血片中有4批样品检出与酸性红73对照品色谱保留时间相同的色谱峰，且190～700 nm的波长范围内的紫外可见吸收光谱一致。4批阳性样品采用HPLC-MS/MS进行确认，呈现与酸性红73对照品溶液色谱保留时间相同的色谱峰，且二者质谱图一致。其他42批次样品均未检出非法染色剂酸性红73。

2.2 HPLC-DAD含量测定

2.2.1 色谱条件 同2.1.2项下色谱条件。

2.2.2 溶液的配制

2.2.2.1 对照品溶液的配制 取2.1.1.1项下对照品溶液I 1 ml，置10 ml量瓶中，加70 %乙醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液III。

2.2.2.2 供试品溶液的配制 按2.1.1.2项下方法配制。

2.2.3 线性关系考察 精密吸取对照品溶液III作为标准曲线溶液1，对照品溶液I作为标准曲线溶液2，取对照品储备液1，2，5 ml，分别加70 %乙醇稀释至10 ml，作为标准曲线溶液3，4，5，对照品储备液作为标准曲线溶液6。取以上标准曲线溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱峰峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，以进样量（X）为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程为：Y=2.9885×106X+7.332×104，r=0.9999，结果酸性红73进样量在0.004712～4.712 μg之间与峰面积具有良好的线性关系。

2.2.4 精密度试验 精密吸取对照品溶液Ⅲ20 μl，连续进样6次，记录峰面积，结果酸性红73峰面积的RSD为0.87 %，表明仪器具有良好的精密度。

2.2.5 重复性试验 取同一舒筋活血片（批号：20440301）6份，分别按2.1.1.2项下方法制成供试品溶液，各进样20 μl分析，记录峰面积，计算含量，结果舒筋活血片中酸性红73含量平均值为2.53 μg/g，RSD为0.85 %。表明本方法具有良好的重复性。

2.2.6 稳定性试验 取同一份舒筋活血片（批号：20440301）供试品溶液，分别于制备后的0，1，2，4，8，12，24 h进样测定，进样20 μl，记录峰面积，结果酸性红73峰面积的RSD为1.20 %，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.7 加样回收试验 取对照品溶液I 2.0，2.5，3.0 ml各3份，分别置9个具塞锥形瓶中，置水浴上蒸干[6]。取已知酸性红73含量的舒筋活血片（批号为：20440301）样品9份，各精密称取2.0 g，分别置上述9个锥形瓶中，各加入70 %乙醇20 ml，超声（功率300 W，频率40 kHz）20 min，滤过，滤液回收溶剂，置5 ml量瓶中，加70 %乙醇至刻度，摇匀，即得。按2.1.2项下色谱条件进行分析测定，计算平均回收率为97.91 %，RSD为0.81 %。结果见表3。

2.2.8 样品中酸性红73染色剂的测定 根据2.1.4项下排查结果，取检出酸性红73舒筋活血片样品，按2.1.1.2项下方法制备供试品溶液，进样20 μl，注入液相色谱仪，进行分析测定，结果4批舒筋活血片样品中酸性红73的含量分别为2.70，2.94，2.53，3.52 μg/g。

3 讨论与结论

3.1 检测波长的选择

采用HPLC-DAD，在190～700 nm进行光谱扫描，发现酸性红73在515 nm处有较强的吸收，因此选择515 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择

文献报道的检测酸性红73等色素的HPLC流动相主要有乙腈-乙酸铵溶液[4,6-7]、甲醇-乙酸铵溶液[5,8]、乙腈-甲酸铵溶液[9]等。本文综合考虑并经实验验证，最终选择乙腈-乙酸铵溶液、乙腈-水梯度洗脱系统分别作为HPLC和HPLC-MS/MS的流动相。

本文采用HPLC-DAD检测舒筋活血片中酸性红73染色剂，采用建立的方法对46批舒筋活血片样品进行了排查，其中4批检出了酸性红73，说明化工染色剂在中成药中的使用情况依然严峻，应引起重视及加大监管力度。