转化生长因子-β通路对胃癌细胞在裸鼠体内增殖、侵袭及slug蛋白和上皮钙黏素基因表达的影响

张子杭，成元华

胃癌起源于胃表层黏膜［1-2］，侵袭和转移是病人死亡的主要原因［3］。胃癌的发病率逐年升高［4］，在全球癌症死亡率中排第二，但其确切发病机制仍未完全阐明。研究发现转化生长因子-β（TGF-β）信号通路参与了胃癌的发生发展［5］，胃癌病人TGF-β1（TGF-β通路激活剂）的高表达可能与病人预后差相关［6-7］。当给予外源性TGF-β1时，肿瘤细胞的生长速度、侵袭能力和转移能力均增加［8］。TGF-β1通过促进肿瘤间质中血管的生长从而增强胃癌细胞侵袭能力，SB431542可抑制激活素受体样激酶（activin receptor-like kinase，ALKs）活力，是ALK家族中ALK-5（TGF-β1型受体）的有效抑制剂，SB431542使胞内信号蛋白Sma和Mad相关蛋白（Smad）2和Smad3不能被激活，进一步抑制其磷酸化过程，TGF-β信号通路因此被阻断。TGF-β信号通路已被证实参与体内上皮间充质转化（EMT）的激活［9］。TGF-β信号转导通路通过Smads的中间传导，使信号得以从细胞外部传入到细胞内部，是TGF-β信号通路传导的关键。相关研究提示，EMT诱导转录因子slug在高分化胃癌中低表达，在低分化胃癌中高表达，而上皮钙黏素（E-cad）的表达则与之相反，不难推测胃癌恶性程度与slug蛋白的表达程度成正比，而与E-cad表达程度成反比。本研究旨在探讨TGF-β信号通路对胃癌HGC-27细胞增殖侵袭能力及裸鼠胃癌异种移植模型中slug和E-cad基因mRNA和蛋白表达的影响，以期进一步为阐明胃癌的发病机制，充实实验依据。本研究起止时间为2021年4月至2022年3月。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系及细胞培养相关试剂 胃癌HGC-27细胞系购自上海传秋生物公司，细胞培养相关试剂购自KATAWA。

1.1.2 实验动物及饲养环境 35只BALB/c雄性裸鼠购自思贝福（北京）生物科技公司［动物生产许可证号：SCXK（北京）2019-0010］，体质量（18±2）g，3～4周龄，饲养于贵州医科大学无特定病原体（SPF）动物房。本研究经贵州医科大学动物伦理委员会（IACUC）批准（批号2101147），接受国际实验动物评价与认证管理委员会的监督和管理。裸鼠饲料和饮用水购自北京华富康生物公司。

1.1.3 实验主要试剂 TGF-β1购自美国Enzo，TGF-β通路阻滞剂SB-431542购自MedChemExpress，二甲基亚砜（DMSO）购自Solarbio Technology公司，细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）试剂盒购自大连美伦生物科技公司，Thermo ScriptTM RT-PCR System试剂盒购自美国Invitrogen公司，酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自上海康朗生物科技公司，slug兔抗人单克隆抗体（1∶1 000）、E-cad兔抗人单克隆抗体（1∶1 000）购自美国CST公司，GAPDH鼠抗人单克隆抗体（1∶4 000）购自Abcam公司，HRP标记山羊抗兔二抗（1∶5 000）、HRP标记山羊抗鼠二抗（1∶5 000）购自ASPEN公司，蛋白质印迹法相关耗材购自索莱宝科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 配置88%RPMI 1640+11%胎牛血清+1%双抗体成分的完整细胞培养基（KATAWA有限公司），在37 ℃、5%二氧化碳恒温培养箱中培养。

1.2.2 构建裸鼠移植瘤模型 当细胞数大于1×108/mL时，将细胞重悬于磷酸缓冲盐溶液（PBS）中。裸鼠皮肤消毒后，向裸鼠背部皮肤注射0.2 mL HGC-27细胞（1×108/mL）。每天同一时间观察裸鼠活动，记录裸鼠肿瘤体积和质量的变化。待实性包块长出，瘤体长径达5 mm后，视为造模成功。

1.2.3 体内实验分组 使用随机数字表法将造模成功的裸鼠分为五组，（1）空白对照组：注射等量生理盐水；（2）激动剂组：皮下注射TGF-β1（1微克/只）；（3）阻断剂组：腹腔注射SB431542（0.7 mg/kg）；（4）激动剂+低浓度阻断剂组：TGF-β1（1微克/只）+SB431542（0.7 mg/kg）；（5）激动剂+高浓度阻断剂组：TGF-β1（1微克/只）+SB431542（1.0 mg/kg）。常规碘伏消毒裸鼠皮肤后，按照体内实验分组进行注射，每3天注射1次，并每3天记录1次裸鼠肿瘤大小，用游标卡尺测量肿瘤长径（a）及与长径垂直的短径（b），由此计算出肿瘤体积V=（a×b2）/ 2并绘制肿瘤生长曲线。密切观察荷瘤鼠的一般情况，如活动、饮食、死亡等情况。饲养24 d后，肿瘤体积≥1 cm3，备好消毒后的手术相关器械，于停药第2天后每组腹腔注射1%戊巴比妥钠0.1 mL麻醉后处死裸鼠，脱颈椎处死裸鼠进行取材并观察肿瘤大体形态，使用游标卡尺记录其体积，滤纸拭干瘤块表面血液后使用电子天平测量其质量（为保证精确，每块肿瘤测量5次，最终取其平均数作为最终数据）取出后的瘤块分为3份，两份放入-80 ℃超低温冰箱用于后期使用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测slug和E-cad蛋白表达情况，另一份放入10%中性缓冲福尔马林中，固定8～18 h后包埋成石蜡块，制作常规苏木精-伊红（HE）染色切片。

1.2.4 常规病理学检查 将肿瘤块按照取材、固定、脱水、透明、浸蜡及包埋的顺序制作成病理切片，通过常规HE染色观察肿瘤的病变及形态特征。

1.2.5 RT-PCR检测slug和E-cad基因mRNA表达按照RevertAid™第一链互补DNA（cDNA）合成试剂盒（美国Invitrogen公司）说明书从肿瘤组织中提取总RNA，然后进行RNA逆转录得到第一链cDNA；人类slug、E-cad基因和GAPDH基因序列由上海盛工公司合成。引物序列如下，slug：正向5'-GAGCATTTGCAGACAGGTCA-3'，反向5'-GCTTCGGAGTGAAGAAATGC-3'；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）：正向5'-GGGAGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3'，反向5'-CCAGTCCAGTGAGCTTCCCGTTC-3'；E-cad：正向5'-AAGGAGGCGGAGAAAGAGGAC-3'，反向5'-CGTCGTTACGAGTCACTTCAGG-3'。单独配置Realtime PCR反应体系，以GAPDH为内参进行荧光定量PCR扩增，采用相对定量比较法，即RNA的相对量=2-ΔΔCt计算。

1.2.6 蛋白质印迹法检测肿瘤细胞和组织中slug和E-cad蛋白的表达 提取总蛋白并使用BCA进行蛋白定量后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）实验（索莱宝科技公司），杂交显色后用Image-ProPlus图像分析软件对蛋白条带进行灰度分析。以各蛋白条带的灰度值代表蛋白的表达量。计算每个蛋白条带的灰度值与对应的内参GAPDH条带灰度值的比值，再进行统计分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0、Graph pad 8.0.2和Image-ProPlus图像分析软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以表示，多组定量数据比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠移植瘤模型的建立与常规病理学检查

2.1.1 构建裸鼠移植瘤模型 使用1×108/mL细胞进行裸鼠背部皮下造模后，观察到裸鼠一般情况无异常，活动能力佳，接种部位未见红肿、破溃等现象。空白对照组于接种细胞后（15±3）d长出长径5 mm以上瘤块视为造模成功。35只裸鼠共造模成功30只，每组6只，成瘤率为90%，造模耗时约1个月，造模成功后，再按照分组进行不同处理。

2.1.2 人胃癌HGC-27裸鼠移植瘤观察 肉眼观察：不同组别裸鼠在接种部位皮下均长出肿块，表面皮肤无破溃，肿块边界不清，肿块与周围肌肉、骨组织粘连，无包膜，灰白色，质中，见多灶性坏死。

镜下观察：肿瘤浸入周围骨骼肌纤维间，无包膜，可见多灶性坏死。肿瘤细胞呈上皮样、圆形或卵圆形，排列成巢团状，细胞核呈泡状。

2.2 TGF-β通路对HGC-27细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响 不同组别HGC-27细胞移植瘤的肿瘤体积不同：经过3 d的生长停滞期后，自第9天起，激动剂组肿瘤生长速度快于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；阻断剂组肿瘤生长速度慢于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；激动剂+高浓度阻断剂组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；激动剂+低浓度阻断剂组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 转化生长因子-β（TGF-β）通路对HGC-27胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤体积的影响/（mm3，）

表1 转化生长因子-β（TGF-β）通路对HGC-27胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤体积的影响/（mm3，）

注：①与空白对照组比较，P＜0.05。②与激动剂组比较，P＜0.05。③与阻断剂组比较，P＜0.05。

组别空白对照组激动剂组阻断剂组激动剂+低浓度阻断剂组激动剂+高浓度阻断剂组F值P值第24天544.00±60.00 854.00±193.00①215.00±73.90①②412.00±36.00②③457.00±169.00②③230.46＜0.001鼠数6 6 6 6 6第9天15.00±4.50 62.00±3.40①5.00±3.00①②13.00±5.20②③13.00±6.30②③32.34＜0.001第12天40.00±10.00 143.00±102.00①13.00±4.50①②32.00±13.00②③35.00±7.20②③36.19＜0.001第15天62.00±4.50 162.00±99.20①23.00±8.10①②58.00±4.00②③58.00±16.70②③200.64＜0.001第18天158.00±31.90 329.00±196.70①62.00±13.50①②148.00±9.50②③138.00±51.30②③88.16＜0.001第21天288.00±61.40 562.00±163.00①153.00±31.50①②249.00±36.80②③254.00±10.00②③87.95＜0.001

空白对照组、激动剂组、阻断剂组、激动剂+高浓度阻断剂组、激动剂+低浓度阻断剂组肿瘤质量分别为（1.52±0.41）g、（2.74±0.52）g、（0.61±0.32）g、（1.63±0.19）g、（1.92±0.49）g（F=94.56，P=0.019），激动剂组的肿瘤质量高于空白对照组（P＜0.05），阻断剂组肿瘤质量小于空白对照组（P＜0.05）。

2.3 体内实验中slug和E-cad基因mRNA和蛋白的表达情况

2.3.1 使用RT-PCR检测肿瘤组织中slug和E-cad基因的mRNA表达水平 对取出的肿瘤组织块使用RT-PCR检测slug和E-cad基因的mRNA表达情况，结果显示：空白对照组、激动剂组、阻断剂组、激动剂+低浓度阻断剂组、激动剂+高浓度阻断剂组slug表达水平分别为1.00±0.00、2.13±0.07、0.57±0.05、0.87±0.02、0.74±0.05（F=82.67，P=0.004），激动剂组slug mRNA表达水平高于空白对照组（P＜0.001），阻断剂组slug mRNA表达水平低于空白对照组（P＜0.001）；空白对照组、激动剂组、阻断剂组、激动剂+低浓度阻断剂组、激动剂+高浓度阻断剂组E-cad表达水平分别为1.00±0.00、0.44±0.04、2.46±0.08、0.77±0.06、0.68±0.03（F=43.19，P=0.022），激动剂组E-cad mRNA表达水平低于空白对照组（P＜0.05），阻断剂组E-cad mRNA表达水平高于空白对照组（P＜0.05）。

2.3.2 使用蛋白质印迹法检测肿瘤组织中slug与E-cad的蛋白表达情况 肿瘤组织匀浆后，进行蛋白质印迹法，结果显示：激动剂组E-cad蛋白浓度低于其他组（P＜0.05）；阻断剂组高于其他组（P＜0.05）；在激动剂+低浓度阻断剂和激动剂+高浓度阻断剂组两组中，slug与E-cad的蛋白表达情况与空白对照组相比，均差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1，表2。

图1 蛋白质印迹法检测裸鼠胃癌异种移植模型体内slug蛋白和E-cad蛋白表达

表2 各组裸鼠胃癌异种移植模型slug与上皮钙黏素（E-cad）的蛋白表达水平比较/

表2 各组裸鼠胃癌异种移植模型slug与上皮钙黏素（E-cad）的蛋白表达水平比较/

注：①与空白对照组比较，P＜0.05。②与激动剂组比较，P＜0.05。

E-cad 0.19±0.02 0.04±0.08①0.42±0.09①②0.16±0.02 ②0.15±0.02 ②210.24＜0.001组别空白对照组激动剂组阻断剂组激动剂+低浓度阻断剂组激动剂+高浓度阻断剂组F值P值鼠数6 6 6 6 6 slug 0.25±0.02 0.53±0.05①0.04±0.06①②0.15±0.04 ②0.12±0.03 ②84.88＜0.001

3 讨论

TGF-β信号转导通路在不同肿瘤中都通过EMT促进肿瘤发生、发展［10］，相关研究表明，TGF-β信号通路对肿瘤的发生和转移有较大影响［11］。激活该信号通路后，上皮细胞获得侵袭特性，其生长速度和转移能力得到提高［12］。肿瘤细胞结构的改变导致黏附力下降，使肿瘤细胞更容易脱落，进而分泌基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）破坏邻近的细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）和基底膜［13］。在TGF-β信号通路中，SMADs蛋白家族介导了TGF-β信号从细胞外进入细胞核的过程，从而诱导肿瘤细胞EMT的进展，调节肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、衰老、迁移等［14］。

EMT主要特征是上皮细胞丧失极性而获得间质特性［15］，典型标志是上皮细胞标志物E-cad表达降低而间质细胞标志物N-cad表达增加［16］。正常生理条件下，E-cad表达于各类正常上皮细胞，介导上皮细胞与上皮细胞之间的紧密连接，在维持细胞的极性和组织结构的完整性中起重要作用［17］。E-cad表达降低或缺失是EMT最显著的特征，同时也是多种肿瘤发生转移及病人出现不良预后的临床评估指标［18］。slug是诱导EMT发生的一种转录因子，同时也是E-cad的上游转录因子，相关研究中发现，slug转录因子的表达情况往往与E-cad表达情况相反。

目前，关于胃癌中EMT和TGF-β信号通路的研究大多集中于细胞层面而未进行动物体内实验。众所周知，体内实验对于基础研究向临床应用转化具有不可替代的作用［19］。因此，本实验使用研究较少的人胃癌HGC-27细胞系，丰富了TGF-β通路研究的实验基础，旨在通过外源性药物激活和阻断TGF-β信号通路，观察胃癌细胞在体内增殖和侵袭能力的变化、瘤体大小与质量以及EMT过程中相关基因slug与E-cad的mRNA与蛋白表达水平的变化。

slug在EMT诱导中具有公认的作用［20］，因此本研究探索了slug蛋白表达情况与E-cad蛋白的表达关系，并加以实验验证。本研究发现：使用TGF-β通路激活剂TGF-β1激活该通路后，肿瘤组织中的slug基因mRNA与蛋白表达水平均升高，而E-cad基因的mRNA与蛋白表达水平均下降；使用TGF-β通路阻断剂SB431542阻断该通路后，肿瘤组织中的slug基因mRNA与蛋白表达均下降，而E-cad基因的mRNA与蛋白表达水平均上升。

蛋白表达水平的改变往往导致生物学行为的改变。激活TGF-β通路所导致的slug与E-cad蛋白表达情况的改变，在裸鼠身上表现为胃癌移植瘤体积和质量增加、肿瘤细胞恶性程度增加，我们观察到当TGF-β通路激活后肿瘤生长速度大幅度上升，相关文献报道：TGF-β通路的激活可诱导血管内皮生长因子（VEGF）生成增加［21-22］。TGF-β1可诱导内皮细胞和成纤维细胞中VEGF的表达，而VEGF可促进肿瘤细胞周围的血管形成，从而增加肿瘤细胞增殖速度。因此可推测本研究在激活TGF-β通路后，VEGF表达增加，促进肿瘤细胞增殖速度从而增加肿瘤体积。

综上所述，当TGF-β通路被激活后，活化的TGF-β受体1将SMAD2和SMAD3磷酸化，磷酸化的SMAD2和SMAD3与SMAD4组装成异二聚体和三聚体复合物，然后进入细胞核［23］，直接与slug的启动子结合以诱导其转录，促使slug结合CDH1的启动子，抑制E-cad蛋白的编码而促进EMT的进展，导致N-cad的表达上升、E-cad的表达下降，TGF-β信号通路可通过改变slug和E-cad基因mRNA和蛋白的表达情况，从而调节胃癌细胞增殖和侵袭能力。