白腐真菌对邻苯二甲酸二甲酯的降解与机理研究

高斯研, 崔康平, 刘 睿, 许向阳, 陈长斌, 汪三六

(1.合肥工业大学 资源与环境工程学院,安徽 合肥 230009; 2.安徽曙光化工集团有限公司,安徽 安庆 246003)

邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)是一种合成的难降解的有机增塑剂化合物[1],广泛用于塑料、软管、玩具、容器等柔性塑料制品的添加剂和增塑剂[2],邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate,DMP)是最重要和最广泛使用的PAEs之一[3]。由于不与主体聚合物发生化学结合,DMP易于从塑料中浸出[4],会存在于沉积物、自然水体、废水、土壤,甚至由于其具有相对较高的蒸汽压力而存在于空气中[5]。在环境中,DMP通过食物链进入雄性哺乳动物体内,对生殖功能有显著损害,如破坏生殖系统、引起睾丸萎缩和精子丢失、改变生殖细胞的超微结构等[6-8]。此外,DMP对雌性哺乳动物的胚胎发育有中度毒性。由于DMP存在苯基、羧基,其水解反应半衰期约3 a,不易在自然环境中降解;由于它的诱变、致畸和致癌性及难降解性,中国环境监测总站和美国环境保护署将其列为优先级有机污染物[9]。因此有必要开发有效的降解处理方法降解水生环境中的DMP污染物。

目前,降解DMP的主要方法有光化学氧化法、预氧化法[10]和生物降解法[11]。由于生物降解法具有低能耗、低成本和可忽略的二次污染等优势,已成为有机化合物污染环境修复的研究热点。生物处理是通过微生物代谢降解和转化有害物质,具有高效和环境相容性等特点[12],酯类烃链较短的PAEs更容易被微生物降解和矿化[13]。因此,寻找有效率的DMP降解菌被认为是清除土壤中DMP残留的首要步骤。目前,分离到的降解DMP的细菌大部分是原核微生物,包括不动杆菌、节杆菌、芽孢杆菌、短杆菌、乳酸菌、巴氏杆菌、黄单胞菌、假单胞菌、白念珠菌、红球菌等[14-17],而真菌降解DMP的相关研究较少。

白腐真菌针对底物的降解具有广谱性[18],可以彻底降解多种难降解有机污染物,而相关实验研究表明,利用白腐真菌降解废水中的金属,可以大大提高废水的治理效率[19]。因此,白腐真菌具有广泛的降解能力、营养物质要求简单、生命力顽强、降解彻底、培养成本低廉及对固液基质的适应性强[20]等特点,在水污染防治中具有成本低、效率高、实用性强等优势[21]。黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)是白腐真菌的一种,因其能产生锰过氧化物酶(manganese peroxidase,MnP)和木质素过氧化物酶(lignin peroxidase,LiP),通过氧化还原反应来攻击多种污染物而受到研究人员关注[22]。白腐真菌具有生物量大、对周围需要修复的生态环境要求低、适应性强的特点,因此多被应用于降解各种芳烃类化合物及农药,其在降解这些物质方面表现出卓越的性能[23-24]。目前,白腐真菌已广泛应用于纺织、纸浆造纸废水的修复等领域[25-27]。

目前,微生物降解PAEs的研究主要集中在细菌降解方面,包括好氧和厌氧细菌,而真菌对PAEs生物降解的研究报道很少。本文将黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium)作为白腐真菌的代表,研究白腐真菌P.chrysosporium对塑化剂中DMP的活化降解条件和机理。具体研究内容如下:① 探讨温度、pH值、DMP的初始质量浓度、葡萄糖质量浓度、H2O2用量和Mn2+用量对DMP降解效率的影响;② 研究白腐真菌P.chrysosporium/DMP体系的机理,包括MnP酶和LiP酶的测定;③ 利用傅里叶变换红外光谱仪(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)测定白腐真菌P.chrysosporium反应前后官能团的变化,用液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)联用仪鉴定DMP的降解产物并讨论其降解途径。

1 实 验

1.1 黄孢原毛平革菌的培养

从中国培养物保藏中心(武汉)购得白腐真菌P.chrysosporiumAF-96007菌株,每30 d在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马铃薯提取物200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L)上传代1次,传代后将培养基置于恒温培养箱中,在30 ℃活化7 d后在4 ℃条件下保存。液体培养时,取出4 ℃下保存的白腐真菌P.chrysosporium,将孢子刮到灭菌后的超纯水中,调节浊度为100 FTU。在高温灭菌后的200 mL液体培养基中接种3 mL孢子悬浮液,置于30 ℃、135 r/min的条件下培养3 d,待菌球进入对数培养期后,投加污染物。液体培养基所含组分如下:

葡萄糖5 g/L、KH2PO42 g/L、

MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CaCl20.1 g/L、

MnSO40.03 g/L、NaCl 0.06 g/L、

FeSO4·7H2O 6 mg/L、CoCl26 mg/L、

ZnSO4·7H2O 6 mg/L、CuSO46 mg/L、

AlK(SO4)2·12H2O 0.6 mg/L、

H3BO30.6 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.6 mg/L、

酵母提取物0.012 g/L、酒石酸二铵0.2 g/L、

维生素B11 mg/L、藜芦醇0.07 g/L、

吐温-80 0.5 g/L。

用1.2 g/L醋酸钠调节溶液pH值至4.5。

1.2 最佳降解条件研究

为了提高白腐真菌P.chrysosporium对DMP的降解效率,探究DMP初始质量浓度、温度、pH值、葡萄糖质量浓度、H2O2用量、Mn2+用量对DMP降解效率的影响。

1) 实验组。待孢子悬浮液培养3 d后,分别投加一定量的DMP储备液,其初始质量浓度分别为1、5、10、15、20 mg/L;培养温度分别设置在25、30、37 ℃;初始pH值分别设置在3.6、4.6、5.6、6.6、7.6;液体培养基葡萄糖的质量浓度分别为5、10、15、20 g/L;在锥形瓶中加入一定体积的H2O2溶液(1 g/L),以达到所需质量浓度为5、10、20、30 μg/L;在锥形瓶中加入一定体积的Mn2+,使锥形瓶中Mn2+质量浓度分别为5.5、11.0、27.0、40.0 mg/L。将上述实验组置于恒温振荡培养箱中恒温振荡培养,每24 h测定体系中DMP质量浓度,通过比较初始和最终DMP质量浓度来计算降解效率,每个样品设置3个平行。

2) 对照组。空白对照为纯培养基,以灭活白腐真菌P.chrysosporium培养基(121 ℃,15 min)处理后DMP质量浓度为吸附对照。

DMP的质量浓度通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)测定,采用紫外吸收检测器和 C18反相色谱柱(5 μm,4.6×150 mm)进行分析。紫外吸收检测器的波长设置为 225 nm,柱温为30 ℃,流动相为水和乙腈(水和乙腈的体积比为3∶7),流速为1 mL/min,出峰时间在2.5 min左右,通过外标法进行定量分析。

1.3 酶活的测定

有研究证明,微生物能够降解有机污染物的原因是其自身能够分泌可用于降解污染物的酶[28]。在污染物的胁迫下,白腐真菌会分泌出孢外酶,如MnP酶、LiP酶,来参与有机污染物的矿化过程。本实验探究最适降解条件下处理10 mg/L DMP的对照组以及 27 mg/L Mn2+实验组中 MnP酶和 LiP酶的活性。

收集实验组中不同降解时间下的白腐真菌P.chrysosporium菌球,于4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min,离心后取上清液用于酶活的测定。

MnP酶的活性是用紫外分光光度计测定其在240 nm处吸光度值的变化来表征。3 mL的反应体系包括 0.4 mL 孢外粗酶液、2.0 mL 琥珀酸缓冲液(丁二酸)(5.9 g/L,pH=4.5)、0.5 mL MnSO4(2.265 g/L)及0.1 mL H2O2(0.34 g/L)。25 °C条件下将H2O2作为反应的启动因子启动酶反应,记录在240 nm下分别反应0、3 min时的吸光度值,定义每min产生1 μmol Mn3+所需要的 MnP 酶量为1个酶活单位。

LiP酶活性是用紫外分光光度计测定其在310 nm处吸光度值的变化来表征。3 mL的反应体系包括0.4 mL孢外粗酶液、1.5 mL 的酒石酸缓冲液(15 g/L,pH=3.0)、1.0 mL 藜芦醇(1.82 g/L)及0.1 mL H2O2(0.34 g/L)。25 ℃条件下将H2O2作为反应的启动因子启动酶反应,记录在310 nm下分别反应0、3 min时的吸光度值,将每min内1 μmol藜芦醇氧化成藜芦醛所需的酶量作为1个酶活单位。

MnP、LiP 酶活的计算公式为:

其中:ΔA为吸光度最大和最小峰之间的差;V1为反应体系的体积,取值为3 mL;Δt为ΔA对应的时间差;V2为酶液体积,取值为0.4 mL;b为比色皿厚度,取值为1 cm;ε为吸光系数,Mn3+的吸光系数为8 100 L/(mol·cm),藜芦醛的吸光系数为9 300 L/(mol·cm)。

1.4 降解机理研究

1.4.1 傅里叶红外光谱分析

为了鉴定白腐真菌P.chrysosporium降解DMP的过程中起主要作用的官能团种类,利用FTIR定性分析白腐真菌P.chrysosporium降解DMP反应前后官能团的变化。取对照组(菌体+10 mg/L DMP)分别降解反应 0、5 d 后的菌体,用超纯水清洗5次后于-60 ℃冷冻干燥机中干燥24 h后,取出将其碾碎。称取约0.1 g研磨后的样品、约0.1 g KBr 粉末,混合均匀后制成半透明压片。检测时,仪器的波数范围为4 000～500 cm-1。

1.4.2 中间产物鉴定

溶液中DMP降解的中间产物使用LC-MS分析。液相色谱条件如下:C18 反相色谱柱,流动相为水(A相)和乙腈(B相)(水和乙腈的体积比为3∶7),流速为 0.2 mL/min,梯度洗脱 15 min 内A相由95%降至0,然后1 min内 A相再升至95%,最后保持5 min;进样量为20 μL,样品DMP质量浓度为10 mg/L。质谱条件如下:负离子模式,保护气温度为450 ℃,毛细管电压为4 500 V,雾化气压力为41.37 kPa(6.0 psig),气帘气压力为55.16 kPa(8.0 psig), 碰撞活化解离(collision-activated dissociation,CAD)为11 L/min,离子源气1(Gas1)为6 L/min,离子源气2(Gas2)为7 L/min,波长为224 nm。

2 结果与讨论

2.1 最佳降解条件研究

本实验通过探究不同温度、pH值、DMP初始质量浓度、葡萄糖质量浓度、H2O2质量浓度、Mn2+质量浓度确定DMP生物降解的最佳降解条件。实验以纯培养基为空白对照,以灭活白腐真菌P.chrysosporium培养基(121 ℃,15 min)为吸附对照。

不同温度、pH值、DMP初始质量浓度、葡萄糖质量浓度、H2O2质量浓度、Mn2+质量浓度对DMP生物降解效率的影响如图1所示。图1中,黄孢菌即黄孢原毛平革菌。

图1 温度、pH值、DMP初始质量浓度以及葡萄糖、H2O2、Mn2+的质量浓度对DMP降解效率的影响

从图1a可以看出:DMP降解效率随温度升高呈先上升后下降;在30 ℃下,DMP的降解效率达到75%,而其他组的降解效率均低于75%。这可能是由于温度会显著影响酶的活性和白腐真菌P.chrysosporium的代谢效率。当温度较低时,酶的活性不强,污染物降解速率一般,通常温度每升高10 ℃,反应速率就会加快1倍左右。然而,酶的本质是蛋白质,若温度过高,则会导致蛋白质的变性,从而使酶失活,酶一旦失活就不能作为促使污染物降解的催化剂,污染物降解效率就会显著下降。因此,将30 ℃设为后续实验的温度。

从图1b可以看出,pH值对白腐真菌P.chrysosporium降解DMP的影响比较大,弱酸性比弱碱性更有利于菌体的降解,当pH=5.6时,DMP降解效率最大。这可能是由于菌体对DMP的降解主要是依赖其分泌的酶活,当pH值高于或低于一定范围时,将影响酶活,从而降低其对DMP的降解能力。因此后续实验将pH=5.6作为反应条件。

由图1c可知:当DMP初始质量浓度小于10 mg/L时,降解效率随DMP质量浓度升高而升高;当DMP初始质量浓度为10 mg/L时,降解效率达到最大值,为75%;当DMP初始质量浓度大于10 mg/L时,降解效率迅速下降。因此,考虑到环境中实际的DMP质量浓度范围和菌体降解特性,后续实验将初始DMP质量浓度设为10 mg/L。

白腐真菌P.chrysosporium在上述最佳条件下对DMP的降解效率仅为75%,为了提升其降解效率,下面实验尝试优化其他参数,探究碳源质量浓度、H2O2质量浓度、Mn2+质量浓度对DMP生物降解的影响。

从图1d可以看出,反应体系中的葡萄糖质量浓度对生物降解效率的影响较大,当葡萄糖质量浓度在5 g/L时,降解效率能达到95%,当其质量浓度为10、15、20 g/L时,降解效率逐渐下降。葡萄糖在体系中作为碳源被微生物利用,当其质量浓度有限时,DMP能很快充当碳源被微生物利用,这加速了污染物的消耗。此外,碳源的短缺可以极大地促进过氧化物酶的产生,而过氧化物酶在有机物的降解中扮演着重要的角色,这也可能是碳源受限的情况下DMP降解效率更高的原因。因此,后续实验将葡萄糖质量浓度设为5 g/L。

有研究显示,H2O2可以激活酶促反应[29]。从图1e可以看出,在30 ℃、pH=5.6、DMP初始质量浓度为10 mg/L下,当体系中H2O2质量浓度为20 μg/L时,DMP被完全去除,此时的降解效率明显高于其他实验组。在仅加20 μg/L H2O2的对照组中,DMP的降解效率为27%,这说明体系中的H2O2并不是通过氧化反应来降解DMP,而是通过激活白腐真菌P.chrysosporium产生酶来降解DMP。当H2O2质量浓度为30 μg/L时,DMP降解效率下降极大,这说明高质量浓度的H2O2抑制酶的产生,不利于DMP降解。

从如图1f可以看出,在30 ℃、pH=5.6、DMP初始质量浓度为10 mg/L下,当体系中Mn2+质量浓度为27.0 mg/L时,DMP降解效率最大,此时的降解效率为100%,而继续增加Mn2+质量浓度,Mn2+的促进作用不明显。

迄今为止,有很多研究者从废水、活性污泥中分离到能够降解DMP的细菌,这种方式耗时长且需要驯化。本次实验表明,真菌,尤其是白腐真菌在DMP的降解中也可以大有作为。

综上所述,温度为30 ℃、pH=5.6、DMP初始质量浓度为10 mg/L是白腐真菌P.chrysosporium降解DMP的最佳降解条件,反应7 d后降解效率达到75%,而此条件下空白对照和吸附对照的降解效率远小于20%,这说明DMP的消失是由于生物的降解而不是吸附。进一步优化反应条件的结果如下:当体系中葡萄糖质量浓度为5 g/L时,降解效率能达到95%;当体系中加入20 μg/L H2O2或者27.0 mg/L Mn2+,都能使DMP降解效率显著提升,达到100%。

2.2 酶促降解研究

几乎所有的白腐真菌都能产生过氧化物酶——MnP酶和LiP酶,这2种过氧化物酶在白腐真菌降解污染物的过程中起着不可或缺的作用。白腐真菌P.chrysosporium暴露在10 mg/L DMP、27.0 mg/L Mn2+中,MnP酶活性随暴露时间的变化如图2所示。

在10 mg/L DMP的胁迫下,MnP酶活性在第1天达到第1个峰值6.11 U/L后,随反应时间增加而增加,在第5天达到最大值8.79 U/L。在整个反应阶段,DMP胁迫下的MnP酶活性均高于对照组。此现象表明,白腐真菌P.chrysosporium在DMP的胁迫下仍能保持较强的活性,其原因主要有以下2个方面:① 白腐真菌P.chrysosporium具有耐DMP的特性,通过分泌大量的MnP酶抵御DMP的侵害;② 随着反应进行,碳源在不断消耗,碳源的受限是白腐真菌P.chrysosporium分泌更多MnP酶的充分条件。而在白腐真菌P.chrysosporium、DMP、Mn2+共存的体系中,MnP酶活性在第5天达到最大值15.51 U/L,这可能是由于Mn2+作为MnP酶的反应底物,能极大地促进白腐真菌P.chrysosporium分泌MnP酶,并在生产MnP酶的过程中利用诱导基因转录调整整个反应过程中MnP酶的生产量,因此,MnP酶在有机物的降解过程中起着不可或缺的作用。MnP酶在Mn2+存在的条件下将Mn(Ⅱ) 氧化成Mn(Ⅲ),从而有效精准地还原底物。锰(Mn)在MnP酶的表达和污染物的降解中起调控作用,低质量浓度的必需重金属物质对分解酶系统的作用是至关重要的。

白腐真菌P.chrysosporium暴露在10 mg/L DMP、27.0 mg/L Mn2+中,LiP酶活性随暴露时间的变化如图3所示。

图3 LiP酶活性随暴露时间的变化

在10 mg/L DMP的胁迫下,LiP酶活性在第6天达到最大值4.25 U/L。LiP酶是白腐真菌P.chrysosporium的次级代谢产物,仅在缺乏氮源的情况下被激活,随着反应进行,氮源被不断消耗,LiP酶活性逐渐增强。在整个反应阶段(第6天除外),DMP胁迫下的LiP酶活性均低于对照组,这说明DMP抑制LiP酶活性。在白腐真菌P.chrysosporium、DMP和Mn2+共存的体系中,LiP酶活性低于对照组(第6天、第7天除外),这说明Mn2+对于LiP酶活性有抑制作用。

从图2、图3可以看出:在3种体系下,LiP酶活性的峰值远小于MnP酶,这说明MnP酶在DMP降解中起着更重要的作用; MnP酶和LiP酶出现峰值的时间不一致,后者稍晚于前者,这可能是由于LiP酶的产生依赖于通过MnP酶氧化草酸生成过氧化氢。

2.3 降解机理研究

2.3.1 傅里叶红外光谱分析

傅里叶红外光谱是利用物质在不同波数下吸收峰不同的性质,来鉴别官能团的种类,如O—H、C—N、C—O、C—N—C、P—O—C等化学键[30]。菌体在DMP环境下分别反应0、5 d后,其红外光谱如图4所示。

图4 DMP降解前后P.chrysosporium菌的FTIR谱图

从图4可以看出:在3 338 cm-1附近吸收峰出现漂移,这表明存在羧基中的—OH伸缩振动;在2 933 cm-1附近出现吸收峰偏移,可能是由于真菌蛋白质上碳氢化合物中的非对称与对称亚甲基的伸展振动[31];吸收峰由1 658 cm-1移动到1 656 cm-1,表明菌体上—C=O 发生伸展振动;在1 300～900 cm-1内出现吸收峰漂移,表明有醇类和羧酸中的C—O伸缩、C—N 伸缩、P—O—C 伸缩、C—O—C 伸缩;在1 000～650 cm-1出现吸收峰漂移,表明有芳烃的C—H面外弯曲振动;吸收峰从3 353 cm-1偏移至3 338 cm-1,对应细胞壁结构中的P—S伸缩变动、—OH伸缩和蛋白质特有的C—N—C剪式振动,这表明羟基发生了多样的变化,由多聚体变为单聚体甚至游离态。

图4结果表明,在DMP生物降解过程中,白腐真菌P.chrysosporium中的羧基、羟基等官能团发挥着重要作用。

2.3.2 DMP降解途径推测

根据LC-MS联用仪检测结果推测,DMP在白腐真菌P.chrysosporium作用下的降解路径主要有3种,如图5所示。

图5 DMP可能的降解路径

1) 侧链缩合成环。在·OH自由基作用下,DMP的2条侧链失去甲氧基,产生水杨酸[32]。

2) 苯环开环。DMP及其一些含苯环的中间产物在·OH 自由基作用下,发生开环,裂解成分子量较小的脂肪酸链,最终降解成无害化的CO2和H2O[33]。

3) 在DMP分子的侧链上,一侧C=O 键发生断裂,在·OH自由基攻击下,DMP裂解形成羟基化中间产物,随着反应继续,侧链上的 C—O 键发生断裂,邻苯二甲酸单甲酯(monomethyl phthalate,MMP)形成,然后MMP经过环化形成邻苯二甲酸酐,最终被降解为无害化的 CO2和H2O[34]。

3 结 论

本文探究不同条件下白腐真菌P.chrysosporium对DMP的最佳降解效果,实验发现:

1) 白腐真菌P.chrysosporium降解DMP的最佳降解条件是温度为30 ℃、pH=5.6、DMP初始质量浓度为10 mg/L,反应7 d后DMP降解效率达到75%。

2) 当体系中加入葡萄糖的质量浓度为5 mg/L时,DMP降解效率为95%;体系中加入20 μg/L H2O2或者27.0 mg/L Mn2+都能使DMP降解效率显著提升,达到100%。

通过测定白腐真菌P.chrysosporium/DMP体系中的MnP酶和LiP酶,发现反应中LiP酶活性的峰值远小于MnP酶,这说明MnP酶在DMP的降解中起着更重要的作用。

实验利用LC-MS联用仪鉴定DMP的降解产物,并讨论3种可能的降解途径,根据检测到的中间产物推测,·OH攻击 DMP 分子中C=O、C—C键等,经过羟基化、环化、开环等过程产生中间产物,随着反应继续,·OH 继续氧化中间产物生成一些低分子物质,最终DMP被氧化成CO2和 H2O。