固相净化结合超高效液相色谱-串联质谱法同时测定九香虫及其成方制剂中10种真菌毒素*

胡 珀，卜媛媛，赵祥杰，何晓希，金 鹏**

1淮安市食品药品检验所，淮安 223001；2淮阴工学院，淮安 223001

真菌毒素是一类由产毒真菌在一定环境条件下产生的具有毒性作用的次级代谢产物[1]，部分真菌毒素已被证实具有致癌、致畸、致突变作用，对人类健康造成很大威胁。目前已知的真菌毒素有300余种，其中常见的易对人体产生危害的有黄曲霉毒素、单端孢霉烯族类毒素、玉米赤霉烯酮等[2]。近年来中药材污染真菌毒素的现象层出不穷，从中药材种植（养殖）、采收到加工、储藏、运输等环节，若条件控制不好就会产生真菌毒素。动物类中药材成分为油脂、蛋白质等高营养物质，贮存不当易受真菌侵染而霉变，真菌毒素污染风险高[3]。污染后的真菌毒素难以彻底消除，须及时检测处理，避免含量超标。目前，对中药材真菌毒素标准的制定及研究主要集中在果实种子类和动物类药材和饮片中，而对制剂的研究却较少。《中国药典》2020 年版规定了24 种中药材黄曲霉毒素限量标准，中药污染真菌毒素问题在业内已引起广泛重视[4]。

九香虫是我国传统的动物药，2020 版《中国药典》 增加了其中药材和饮片的黄曲霉毒素检查项，而含有九香虫制剂暂无该检查要求。本机构在含九香虫制剂日常检验的同时，进行了黄曲霉毒素风险项探索性研究，发现有黄曲霉毒素超标的情形。本研究通过MFC100 固相净化柱净化，超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS）检测，建立了九香虫及其成方制剂中10 种真菌毒素 [黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黄曲霉毒素B2（AFB2）、黄曲霉毒素G1（AFG1）、黄曲霉毒素 G2（AFG2），伏马毒素B1（fumonisin B1，FB1）、伏马毒素B2（FB2），T-2 毒素（T-2 toxin，T-2），呕吐毒素（deoxynivalenol，DON），赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）及玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZON）]的检测方法，并成功用于实际样品的污染风险评估。

1 材 料

1.1 仪器

UltiMate3000 超高效液相色谱仪（美国ThermoFisher 公司）；QTRAP 4500 三重四极杆质谱仪、Analyst 采集软件和MultiQuant 3.0.2 分析软件（美国SCIEX 公司）；XS205DU 电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；T25 easy clean 均质分散机（德国IKA 公司）。

1.2 药品和试剂

10 种真菌毒素混标溶液（批号S095939，浓度AFB1：0.8 μg·mL-1、AFB2：0.4 μg·mL-1、AFG1：0.8 μg·mL-1、AFG2：0.4μg·mL-1、FB1：8μg·mL-1、FB2：8μg·mL-1、T-2：8μg·mL-1、DON：199.7μg·mL-1、OTA：0.8μg·mL-1、ZON：2 μg·mL-1）购自阿尔塔科技有限公司；MFC100固相净化柱购自青岛普瑞邦生物工程有限公司。

九香虫药材（产地：贵州、云南）购自亳州市同善堂中药材有限责任公司；九香虫饮片购自安国市东方红药材公司（批号202209，产地云南；批号202208，产地湖南）和江苏承开中药有限公司（批号220901，产地湖北）；疏肝益阳胶囊（规格：0.25 g，批号：221115）购自贵州益佰制药股份有限公司；茸血补心丸（规格：9 g，批号：220301）购自辽源誉隆亚东药业有限责任公司；康力欣胶囊（规格：0.5 g，批号：20220802）购自云南名扬药业有限公司。

甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，实验用水由Milli-Q纯水机制得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters Acquity UPLC®BEH C18色谱柱（2.1mm×100 mm，1.7 μm）；柱温30℃；自动进样器10℃；0.1%甲酸水溶液为流动相A，甲醇-乙腈（1∶1）为流动相B，以0.3 mL·min-1的流速梯度洗脱（A∶B）：0 min（95∶5）→2.0 min（95∶5）→2.1 min（60∶40）→7 min（45∶55）→10 min（30∶70）→10.5 min（10∶90）→11 min（95∶5）→13 min（95∶5）；进样体积5 μL。

2.2 质谱条件

电喷雾离子化多反应监测正负离子同时检测。雾化电压5500 V；离子传输温度500℃；去簇电压和碰撞能量见表1。对照品溶液的总离子流图见图1。

图1 混合对照品溶液总离子流图

表1 10 种真菌毒素对照品质谱分析参数

2.3 溶液的制备

2.3.1 供试品溶液的制备 取九香虫粉末及其成方制剂粉末约5 g，精密称定，分别置于50 mL 离心管中，加入20 mL 乙腈-水-甲酸（84∶15.9∶0.1），均质2 min，用定性滤纸过滤，精密量取4 mL 滤液至无荧光的玻璃管中，过MFC100 固相净化柱，取净化液，待测。阳性超标样品，取续滤液定量稀释后检测。

2.3.2 系列基质混合对照品溶液的制备 取空白基质样品产地湖北约5 g，精密称定，按“2.3.1”项下方法处理，取净化液作为空白基质，分别精密加入10 种真菌毒素混标溶液，配制成系列基质混合对照品溶液，其中AFB1、AFG1和OTA 浓度为0.2、0.4、1、2、4 ng·mL-1，AFB2和AFG2浓度为0.1、0.2、0.5、1、2 ng·mL-1、FB1、FB2和T-2 浓度为2、4、10、20、40 ng·mL-1、DON 浓度为49.9、99.8、249.6、499.2、998.5 ng·mL-1，ZON 浓度为0.5、1、2.5、5、10 ng·mL-1。

2.3.3 系列溶剂混合对照品溶液的制备 取10 种真菌毒素混标溶液适量，用乙腈-水-甲酸（84∶15.9∶0.1）稀释配制成系列溶剂混合对照品溶液，10 种真菌毒素浓度同“2.3.2”。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性、重复性和稳定性试验 同步开展空白试验，空白样品无干扰，表明该方法专属性良好。取九香虫样品粉末5 g，称取6 份，加入25 μL 10 种真菌毒素混标溶液，制备加标供试品溶液测定，10种真菌毒素的峰面积RSD 均≤10%，表明该方法重复性良好；取基质混合对照品溶液放置0、2、4、8、12、24 h 后测定10 种真菌毒素的峰面积，结果峰面积的RSD 均≤10%，表明基质混合对照品溶液中10 种真菌毒素在24 h 内均稳定。

2.4.2 校准曲线、检出限和定量限 测定系列基质混合对照品溶液，以各化合物的质量浓度和响应值峰面积绘制标准曲线。结果表明，10 种真菌毒素在各自质量浓度范围内线性关系良好，r>0.999。以3倍信噪比（S/N）计算检出限LOD，以10 倍S/N 计算定量限LOQ。结果见表2。

表2 线性方程及检出限、定量限

2.4.3 准确度和精密度试验 取同一批次九香虫样品粉末约5 g，精密称定，称取18 份，6 份为一组，按低、中、高3 个浓度水平分别精密加入10 种真菌毒素混标溶液10、25、50 μL，依次制备供试品溶液并测定含量，计算回收率，结果见表3。可见10 种真菌毒素的平均回收率为62.3%～106.6%，RSD ＜10%。

表3 回收率试验结果（n=6）

2.4.4 实际样品分析测定 检测收集的2 批九香虫药材、3 批九香虫饮片、3 批含九香虫制剂，其中7批样品有检出，结果见表4。

表4 实际样品分析测定结果

根据《中国药典》2020 年版九香虫[1]项下规定，本品每1000 g 含AFB1不得过5 μg，含AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的总量不得过10 μg，共5 批超出限量标准。

3 讨论

3.1 液-质条件的优化

针对真菌毒素的ESI-MS/MS 检测,在流动相水相中添加挥发性有机酸时，响应明显增强。分别考察了乙腈-0.1%甲酸水，甲醇-乙腈（1∶1）-0.01%甲酸水、甲醇-乙腈（1∶1）-0.1%甲酸水流动相系统。采用甲醇-乙腈（1∶1）-0.1%甲酸水流动相系统获得了良好分离和检测灵敏度。

T-2 毒素分子量为466.52，在《中国药典》2020年版中，选择的母离子为489.2，结合形式为[M+Na]+。本研究中发现T-2 毒素更易结合为[M+NH4]+，峰强度也较高，其定量离子对，定性离子对均有较好的峰型，故选择484.2 为母离子。

3.2 前处理条件的优化

本实验采用均质提取法能够快速分散样品，制得更均一的混合溶液。目前，常用的毒素提取溶剂主要包括甲醇、乙腈和水，本实验比较了不同比例甲醇-水、乙腈-水提取效果，乙腈-水（84∶16）的提取效率高，溶液峰形较好且较为稳定，乙腈-水（84∶16）对大多数化合物具有适当的极性，加入0.1%甲酸后，OTA 和ZON 回收率变高，综合考虑选择乙腈-水-甲酸（84∶15.9∶0.1）作为提取溶剂。

净化的前处理耗材一般有通用性固相萃取柱、免疫亲合柱和固相净化柱。固相萃取柱以硅胶、C18、硅酸镁等作填料，可选择性吸附和洗脱，是目前国际上较为常用的检测真菌毒素样品的前处理方法之一，适用于简单基质，但净化时间长。免疫亲合柱既可单独净化得到一种或一类毒素，也可同时净化得到几类毒素，但是净化效果容易受样品基质、pH、溶剂等因素的影响，同时价格昂贵、净化时间长。已商品化的真菌毒素固相净化柱中的填料包含活性炭、硅胶、氧化铝、极性或非极性材料、离子吸附树脂等，其原理是过柱后将干扰物等截留在柱内，样液中的毒素不被吸附而直接通过，与免疫亲合柱和固相萃取柱的原理相反[5]，因待测组分直接通过柱子，无平衡、淋洗和洗脱过程，而使净化时间缩短。本实验使用的固相净化柱MFC100 可吸附杂质、脂类和蛋白质，适用于多毒素净化，净化时间短，回收率在可接受范围，故选择MFC100 固相净化柱前处理方法。

3.3 基质效应

ESI 源中基质效应的产生是受到共流出物质的干扰，产生竞争性电离，导致目标物响应增强或者降低的现象[6，7]。基质效应（matrix effect，ME）在±20%之间为可接受范围，其计算公式为ME（%）=[（A2-A1）/A1]×100，式中：A1为加标溶剂的峰面积；A2为同浓度加标空白基质峰面积[8]，结果＞0 说明有基质增强效应，＜0 则说明有基质抑制效应。结果显示，10 种真菌毒素的基质效应除DON 为基质增强效应，其余9 个均为基质抑制效应，因此基质效应不可忽略。如FB1在九香虫基质抑制作用严重，达-77.6%，而DON 在九香虫基质中则存在基质增强效应，为17.7%。这可能是由于样品提取液中的油脂以及磷脂类物质等影响了某些目标物的离子化效率导致的结果。消除基质效应最佳方法是采用适宜的同位素内标，但是在真菌毒素较多的情况下，找到适用于每种真菌毒素的内标物较为困难且价格昂贵，本研究标准曲线通过空白基质加标制备，可以在现有条件的基础上最大程度的减弱基质效应，保证实验结果的准确性。

4 结论

本研究建立了九香虫药材、饮片及其制剂中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、FB1、FB2、T-2、DON、OTA、ZON 共10 种真菌毒素的检测方法，该方法简便、快速、准确。实验结果表明除一批九香虫饮片未检出真菌毒素外，其他7 个样品均被真菌毒素污染，说明九香虫易受黄曲霉和镰刀菌污染，应为九香虫制剂建立残留限量标准。

动物药基质营养丰富，易霉变产生真菌毒素，且后者与周围环境的温度、湿度、基质、pH 值有密切关系。目前，多数动物药并未明确规定冷藏、防潮等贮藏条件，霉变的样品在市场上多见。有研究表明，适宜的干燥程度和较低的贮藏温度可以有效控制霉菌生长[8]，需要进一步研究霉菌在不同条件下的生长规律，遏制污染，为九香虫药材、饮片及其制剂的安全使用提供保障。