六种猪口蹄疫OA 二价灭活疫苗免疫效果的评估

杨宗维 庞伟兴 罗丽萍 杨亚娟 秦国海

（桂林力源粮油食品集团有限公司技术中心，广西桂林 541000）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病。可引起猪牛羊等多种偶蹄家畜和野生动物发生严重疾病，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的传染病之一，被我国列为一类动物疫病[1]。口蹄疫病毒根据血清学试验可以分为7 种血清型，分别为O 型、A 型、C 型、亚洲1型（Asia1）、南非1 型（SAT1）、南非2 型（SAT2）和南非3 型（SAT3）[2]。根据7 个血清型的同源性又将其分为2 个群即O、A、C 型和亚洲1 型为一群，SAT1、SAT2、SAT3 为一群，2 个群之间的血清型同源性仅为25%～40%，群内同源性可达60%～70%，但血清型之间无交叉和交叉免疫现象[3]。亚洲流行O 型口蹄疫，偶有点发A 型口蹄疫[4]。为了全面保护生猪养殖，多价口蹄疫苗产品成为了市场主流[5]。依据农业农村部公告第2 635 号，我国亚洲1 型口蹄疫已达到全国免疫无疫标准。按口蹄疫流行的血清型分析，以O 型和A 型2 个血清型为主，其中O 型以Mya-98 和PanAsia 为主，A 型以Sea-97 株为主[6]。疫苗接种依然是特异性预防口蹄疫的有效手段，而口蹄疫灭活疫苗由完整病毒经过灭活后制成，在预防和控制口蹄疫的过程中发挥着重要作用[7]。根据口蹄疫的特点，选择优质高效口蹄疫疫苗，也是构建规模化猪场生物安全体系的重要内容[8]。综上所述，本试验旨在为养殖企业快速长效地提高猪群抗口蹄疫免疫力，筛选出高纯度、高效价的猪用口蹄疫OA二价疫苗提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

在桂林力源粮油食品集团某养殖基地，选取52 日龄同批次仔猪1 341 头，猪群健康状况良好。

1.2 试验疫苗

试验疫苗采购自市场常见6 个国内品牌，均为猪用OA 二价灭活疫苗，厂家标记为A、B、C、D、E、F。

1.3 试验试剂

2 种O 型、A 型抗体检测试剂盒，S1 购自北京金诺百特科技有限公司，S2 购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

1.4 试验方法

1.4.1 疫苗146S 含量测定

试验疫苗进行盲标后，送中国科学院过程工程研究所、中牧实业股份有限公司兰州生物药厂、中农威特生物科技股份有限公司、申联生物医药（上海） 有限公司进行各疫苗146S含量检测，146S 测定方法为蔗糖密度梯度离心法。

1.4.2 动物试验

⑴疫苗免疫及分组：将1 341 头52 日龄仔猪随机分为1 至6 组，各组仔猪实际头数分别为219 头、251 头、203 头、216 头、236 头、216 头。依次于52 日龄、85 日龄免疫A、B、C、D、E、F 等6 种口蹄疫疫苗，每次免疫1 头份。除口蹄疫苗外的其他疫苗免疫程序、饲养方式、保健方案等均保持一致。

⑵监测时间：分别于一免后26 d（78 日龄）、二免后30 d（115 日龄）、出栏前（170 日龄）3 次从每组随机挑选25 头猪进行颈静脉采血，检测免疫后抗体。

⑶抗体结果判定与计算：S1 试剂盒O 型抗体、A型抗体判定标准：S/N≤0.5 为阳性，S/N＞0.5 为阴性。S2 试剂盒抗体合格率计算模型：O 型抗体、A 型抗体效价≥1∶128 为合格，效价＜1∶128 为不合格，分别计算每种疫苗免疫后的O 型抗体合格率和A 型抗体合格率，并以O 型抗体合格率与A 型抗体合格率的平均值计算为疫苗的抗体合格率。S2 试剂盒平均抗体效价计算模型：计算每种疫苗免疫后的O 型抗体平均效价与A 型抗体平均效价，因为目前国内主要流行的是O 型口蹄疫，因此O 型和A 型按7∶3 的权重计算每种疫苗免疫后的加权平均抗体效价。

2 结果与分析

2.1 146S 含量

4 家检测单位测定146S 含量见表1、图1，6 个疫苗的146S 含量差异明显。虽然同一厂家同一批次的疫苗在不同检测机构的检测结果各不相同，但通过图1 折线图可以看出，各检测机构检测的结果在趋势上相同。为降低实验室之间的检测误差，最终以4 家机构检测结果的平均值进行对比。结果显示，所有厂家疫苗的146S抗原含量均超过10 μg/头份，其中疫苗A、E 的抗原含量超过30 μg/ 头份，疫苗D、F 的抗原含量在20～30 μg/头份之间，疫苗B、C 的抗原含低于20 μg/头份。

图1 每毫升疫苗146S 含量

表1 疫苗中的146S 含量（μg/mL）

2.2 抗体水平

2.2.1 一免后抗体水平

通过表2 结果可看出，猪群第1 次免疫后，A、C、D 和E 等4 种疫苗的O 型和A 型抗体阳性率均达到100%，疫苗B 和F 的抗体阳性率略低，最低为88%。所有疫苗免疫1 次后的O 型和A 型抗体阳性率均超过70%，符合国家动物疫病强制免疫指导意见。

表2 一免后S1 试剂盒检测结果

S2 试剂盒既可判断抗体合格率又可测定抗体效价，本试验对所有血清进行了效价测定，并计算了所有疫苗首免后抗体平均效价和抗体合格率，抗体结果列于表3。从表3 可以看出，疫苗B、C 和E 厂家的O 型抗体合格率超过70%，其余3 个疫苗均低于70%。所有疫苗的A型抗体合格率普遍高于对应的O 型抗体合格率，只有疫苗F 的抗体合格率低于70%。根据首免抗体的合格率来看，不是所有疫苗均能达到国家对口蹄疫抗体合格率不低于70%的要求。比较O 型和A 型的平均抗体合格率，疫苗在一免后的排名顺序为：C＞E＞B＞A＞D＞F。

2.2.2 二免后抗体水平

二免血清用S1 试剂盒检测的抗体结果列于表4，通过表4 可看出，猪群第2 次免疫6 种疫苗后，除免疫疫苗F 的O 型抗体阳性率为92%，免疫其他5 种疫苗O 型抗体阳性率都能达到100%。且免疫疫苗C 和E 的A 型抗体阳性率也达到100%，疫苗A、B、D 的A 型抗体阳性率在90%以上，疫苗F 的A 型抗体阳性率最低，为88%。

表4 二免后S1 试剂盒检测结果

二免血清用S2 试剂盒的抗体检测结果以及平均抗体效价和抗体合格率同列于表5，从表5 看出，6 种疫苗加强免疫后，O 型的抗体合格率均超过70%，其中疫苗B、C、E 高达100%，疫苗F 最低，仅为72%。对于高度烈性传染病来说，加强免疫后1 个月的抗体合格率仅为72%，显然太低，在疫苗筛选时应该直接剔除。在A 型抗体方面，6 个疫苗诱导的抗体反应和平均抗体效价均较好，远超70%的最低要求。综合S2 试剂盒检测的平均抗体合格率和平均抗体效价，疫苗在二免后的排名顺序为：E＞C＞A≈B＞D＞F。

2.2.3 出栏前抗体水平

通过表6 可看出，猪群出栏前抗体水平，除免疫F疫苗的抗体阳性率为96%外，免疫其他5 种疫苗O 型抗体阳性率都能达到100%。且免疫疫苗B、C、D 和E的A 型抗体阳性率也达到100%，免疫疫苗A 和F 的A型抗体阳性率在90%以上。

由表7 可看出，所有疫苗的O 型和A 型的抗体合格率均高于70%，其中疫苗C 和疫苗E 的O 型和A 型的抗体合格率均高达100%，且平均抗体效价也最高，均超过400。疫苗A 和疫苗B 的抗体合格率和平均抗体效价都相近，无显著差异。疫苗F 的出栏前平均抗体效价也较高，但样本间的抗体效价差异很大，尤其是O 型抗体，有24%的＜128、44%为128～256、12%为256～512、12%为512～1024、有8%的≥1 024，如此悬殊的差异说明免疫抗体的产生可能与猪只个体存在很大的关系。综合O 型和A 型抗体合格率和平均抗体效价，疫苗在出栏前抗体的排名顺序为：E≈C＞B≈A＞D＞F。

表7 出栏前S2 试剂盒检测结果

3 讨论

口蹄疫疫苗的质量与抗原含量存在直接的关系，具体抗原含量达到多高才算合格，国际上没有统一的标准。本试验仅检测了各疫苗的146S 抗原含量，排名顺序为：E＞A＞F＞D＞B＞C。其中疫苗E 和A 的每头份抗原含量超过30 μg、疫苗D 和F 的抗原含量在20～30 μg、疫苗B 和C 的抗原含量在20 μg 以下。

根据S1 试剂盒检测结果，首免后抗体阳性率最低的F 疫苗也达到了88%，说明6 种疫苗免疫后都可以在1 个月内产生有效的抗体应答。不同抗体检测方法对猪口蹄疫疫苗临床免疫评价的阳性率差异不明显[9]，S1 试剂盒只能进行定性检测，难以评价每种疫苗的免疫质量差异。液相阻断ELISA 与病毒中和试验高度相关[10]，为此，本文用S2 试剂盒再次测定了O 型和A 型的抗体效价。结果显示，疫苗C 的首免O 型和A 型抗体合格率均达到100%，平均效价超过256，为所有疫苗中最好，可是疫苗C 的146S 抗原含量在6 个评估疫苗中最低，特别是远低于疫苗E 和疫苗A。146S 粒子易受环境影响分解[11]，说明疫苗抗原含量评价口蹄疫疫苗质量有不确定性。口蹄疫疫苗是一种油佐剂灭活疫苗，其起保护作用的主要因素是免疫抗体。因此，对于猪场来说更应该把免疫抗体作为筛选疫苗和免疫质量评价的重要因素。本研究中依据S2 试剂盒的检测结果综合考虑O 型和A型疫苗的免疫抗体，各疫苗的首免抗体排名为：C＞E＞B＞A＞D＞F。综合来看，疫苗C 和E 能够在一免后为猪群防控口蹄疫O 型和A 型感染提供更快速有效的保护。

加强免疫后，通过S1 试剂盒检测结果，疫苗C 和E 的保护率优于其他疫苗。结合S2 试剂盒的检测结果，二免后猪群抗体合格率都有一定程度提升，但A 型平均抗体效价有升有降。综合来看，疫苗C 和E 在二免后能够全面产生口蹄疫O 型和A 型抗体，且疫苗E 的抗体效价相对更高。同时疫苗B 和D 在分别针对O 型和A型口蹄疫方面表现出一定优势。

口蹄疫疫苗的免疫持续期为6 个月，但由于流行毒株和疫苗毒株在抗原性上存在一定的差异，疫苗诱导的针对流行毒株的免疫保护期可能会缩短，抗原差异越大免疫保护期就越短[12]。出栏前S1 试剂盒检测结果显示，各组抗体水平有了进一步升高，说明6 种疫苗保护期可满足出栏（170 日龄）需求。结合S2 试剂盒检测结果，此时各组之间抗体水平差距缩小，且都有强阳性的结果，出栏前6 种疫苗O 型抗体合格率排序为C≈E＞B≈A＞D＞F。综合来看，免疫疫苗C 和E 的猪群的抗体效价更高、长效保护率更好。

对比首免、二免和出栏前的抗体排名情况，首免抗体较好的疫苗C 和疫苗E，在加强免疫后1 个月和出栏前的抗体水平也一直最好，在6 种疫苗中始终保持靠前水平。疫苗D 和疫苗F 的首免抗体较差，在二免后和出栏前的抗体水平也最差。因此，本文认为仅用首免后1个月的抗体结果完全可以作为筛选疫苗和进行疫苗免疫质量评价的依据。由于不同品牌的试剂盒，检测结果有差异[13]，建议结合目的筛选合适的试剂盒作为评价的工具。

在本研究中，疫苗A、D 和F 首免1 个月的O 型抗体合格率均低于国家动物疫病强制免疫指导意见对口蹄疫疫苗免疫抗体不低于70%的要求，在3 次抗体检测排名中，这3 种疫苗均排名靠后，因此，建议对于首免1个月的S2 试剂盒O 型抗体合格率低于70%的疫苗可以直接淘汰。

有文献报道，口蹄疫疫苗免疫效果与抗原含量呈正相关[14]。本试验根据146S 的检测结果，在6 种疫苗中，疫苗A 和E 的抗原含量最高，均超过30 μg，但二者的3 次抗体检测结果均存在巨大差异，说明相同抗原含量的疫苗不一定能诱导产生同样的免疫抗体反应。同样，疫苗C 的抗原含量仅为13.4 μg，约为疫苗E 的1/3，但二者免疫后的抗体结果非常接近，均达到较高水平，在3 次抗体检测结果中均排名前2 位，说明抗原含量并不是越高越好，疫苗的免疫效果除了与抗原含量有关外，还与疫苗种毒的免疫原性、佐剂等也有关系。有文献指出，如果疫苗中存在高浓度的非抗原蛋白会抑制口蹄疫146S 抗原的免疫效果[15]。

4 结论

146S 抗原含量是影响口蹄疫疫苗质量的重要因素之一，本次试验认为单纯的通过146S 含量无法评估一款口蹄疫疫苗的保护效果，还需要结合更多的产品数据及动物试验。本试验建立了口蹄疫OA 疫苗S2 试剂盒的平均抗体合格率和加权平均抗体效价的计算模型，并评价了6 个厂家疫苗的质量差异，为后续开展口蹄疫疫苗质量评估提供了依据。