非生物胁迫对金龙胆草主要成分积累的影响及隶属函数分析

高静雷,杨彩红,孙 蓉*,刘 姗

(1.攀枝花学院生物与化学工程学院,四川攀枝花 617000;2.攀枝花市林业技术服务中心,四川攀枝花 617000)

《中华人民共和国药典》记载金龙胆草(ConyzabliniiH.Lév)具有清热化痰、止咳平喘、解毒利湿、凉血止血作用,可用于治疗肺热咳嗽、痰多气喘、咽痛等疾病[1]。与大多数中草药相同,金龙胆草含有丰富的次生代谢物,包括萜类、黄酮类、挥发油及生物碱等,其中皂苷、苦蒿素和黄酮为其主要药用成分[2]。早期临床试验证明金龙胆草皂苷对治疗慢性支气管炎有一定疗效且无明显副作用[3-4]。齐永清等[5]研究表明金龙胆草总皂苷具有促进呼吸道清除异物和抑制咳嗽的作用;此外金龙胆草皂苷对宫颈癌及肺癌细胞具有一定的抑制效果[6-7]。苦蒿素是该草药的特征化合物,药典要求金龙胆草干燥品苦蒿素含量不得少于0.30%,研究表明其可明显地抑制幽门结扎大鼠胃溃疡的形成[8];金龙胆草中的黄酮类物质主要包括芦丁、槲皮素、山奈酚、圣草素及它们的衍生物等[3,5,9],具有抗衰老、抗肿瘤、降血脂、抗病毒、止咳等作用。

金龙胆草药材资源以野外生长为主,由于环境的变化,目前该药材资源正在日益减少,同时因其栽培周期较长、易受病害侵袭、对生长环境要求高等,难以大规模人工种植,且次生代谢物在原植物中含量偏低,一系列原因致使该药材的开发利用受限,难以满足社会需求。提高次生代谢物含量、增加金龙胆草耐受性是改变现状的重要举措。外界环境因素(如干旱、低温、高盐、外源激素等)可通过激活细胞信号转导通路,调控转录因子,影响关键酶基因的表达,从而合成和积累次生代谢产物,增加植物系统抗性,使植物产生胁迫耐受[10]。例如紫外光胁迫后转MtIFS1基因的苜蓿(Medicagosativa)中出现了一个新的异黄酮化合物[11]。低温胁迫24 h大豆(Glycinemax)根部总酚酸和异黄酮含量均增加[12]。徐茂军[13]研究发现在长春花萜类吲哚生物碱的合成过程中,茉莉酸甲酯(MeJA)能够调节长春花碱的合成,以提高其含量。该研究通过紫外、干旱、高盐、低温和外源茉莉酸甲酯胁迫金龙胆草,检测皂苷、苦蒿素和黄酮含量的变化,探讨提高金龙胆草次生代谢物含量的有效手段,为培育高含量、高胁迫耐受金龙胆草植株提供基础材料,也为金龙胆草药物的应用提供资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料金龙胆草植株2020年夏通过种子盆栽于攀枝花学院温室,经四川农业大学生命科学学院陈惠教授鉴定为金龙胆草(ConyzabliniiH.Lév)。待植株长至蕾薹期后将其分为5组,每组9盆进行胁迫试验,在上、中、下部位各随机选取叶片进行含量测定。

1.2 试验方法

1.2.1盐胁迫处理。取长势一致蕾薹期金龙胆草植株进行盐胁迫试验,盐胁迫浓度为200 mmol/L,盐胁迫时间为0(CK)、24和48 h,培养温度为室温,光照为正常日光,每个次生代谢物组设置3个生物学重复。处理0、24和48 h分别取一次样,取样时间在09:00—10:00。取完每个样品后在60 ℃恒温烘干至恒重,研磨成粉保存,用于次生代谢物含量的测定。

1.2.2低温胁迫处理。低温胁迫试验胁迫温度为4 ℃,胁迫时间为0 (CK)、24和48 h,光照为正常日光,正常浇水,每个次生代谢物组设置3个生物学重复。处理0、24和48 h分别取一次样,取样时间在09:00—10:00。取完每个样品后在60 ℃恒温烘干至恒重,研磨成粉保存,用于次生代谢物含量的测定。

1.2.3干旱胁迫处理。采用盆栽控水法,自然干旱的方式进行干旱胁迫处理,在处理前,所有材料均充分灌溉,并采样作为对照(0 d),之后分别在10和15 d取一次样,培养温度为室温,光照为正常日光,每个次生代谢物组设置3个生物学重复。取样时间在09:00—10:00。取完每个样品后在60 ℃恒温烘干至恒重,研磨成粉保存,用于次生代谢物含量的测定。

1.2.4紫外胁迫处理。将试验材料放置于垂直距离为45 cm的40 W紫外灯下,胁迫时间为0(CK)、24和48 h,培养温度为室温,正常浇水,每个次生代谢物组设置3个生物学重复。取样时间在09:00—10:00。取完每个样品后在60 ℃恒温烘干至恒重,研磨成粉保存,用于次生代谢物含量的测定。

1.2.5茉莉酸甲酯处理。用100 μmol/L茉莉酸甲酯-0.25%乙醇溶液每隔2 h喷施叶面一次,分别于喷施前0 h(CK)和喷施后24、48 h取样,培养温度为室温,光照为正常日光,每个次生代谢物组设置3个生物学重复。取样时间在09:00—10:00。取完每个样品后在60 ℃恒温烘干至恒重,研磨成粉保存,用于次生代谢物含量的测定。

1.3 含量测定方法

1.3.1皂苷含量测定。采用乙醇超声提取法提取皂苷,取样品粉末0.1 g加入10 mL 70%乙醇,密封,70 ℃,40 kHz超声波提取40 min,提取后的溶液12 000 r/min离心5 min,取上清于干净试管中,在烘箱挥干至恒重,加入0.3 mL 5%香草醛溶液(用冰醋酸配制)、0.8 mL高氯酸,65 ℃水浴25 min,取出用冷水终止反应,随即加入5 mL冰醋酸,摇匀备用,在544 nm 处测定吸光度,按公式(1)计算含量。

(1)

式中:c为标准曲线计算的仪器检测浓度(mg/mL);V1为提取液定容量(mL);V2为测定时定容量(mL);M为称取药材量(g)。

取3 mg齐墩果酸用70%乙醇定容至10 mL,分别取0、100、200、300、400、500 μL溶液,通过上述方法测定吸光度,绘制标准曲线。

1.3.2苦蒿素含量测定。采用甲醇浸提法提取苦蒿素,取样品粉末0.1 g加入4 mL甲醇37 ℃浸提过夜,12 000 r/min离心10 min,取上清液,利用0.22 μm有机相滤头过滤,将滤液装入液相样品瓶中,通过高效液相色谱法(HPLC)检测苦蒿素含量。

HPLC条件:以安捷伦C18柱(150 mm×4.5 mm×5 μm)为色谱柱,柱温25 ℃,流动相为甲醇∶水∶乙腈=40∶45∶5,进样量为10 μL,流速为1 mL/min,检测波长为210 nm。标准品浓度为12.5、25.0、50.0、75.0、100.0 mg/L。

1.3.3黄酮含量测定。采用乙醇超声提取法提取黄酮,取样品粉末0.1 g加入3 mL 65%乙醇,密封,70 ℃,40 kHz超声波提取30 min,抽滤取滤液。再在滤渣中加入3 mL 65%乙醇,重复上述操作,合并滤液。加入6 mL石油醚过夜浸提,使用分液漏斗分离并收集下层液体,通过0.45 μm有机相滤头过滤,取滤液进行含量测定。取1 mL滤液于25 mL烧杯中,依次加入0.5 mL 5% NaNO2,放置6 min;加入0.5 mL 10% Al(NO)3,放置6 min;加入4 mL 10% NaOH溶液,最后用65%乙醇定容至10 mL,室温下反应15 min。在510 nm处测定吸光度,按公式(2)计算含量。

(2)

式中:c为标准曲线计算的仪器检测浓度(mg/mL);V1为提取液定容量(mL);V2为测定时定容量(mL);V3为吸取测定量(mL);M为称取药材量(g)。

取25 mg芦丁用65%乙醇定容至25 mL,分别取0、200、400、600、800、1 000 μL溶液,通过上述方法测定吸光度,绘制标准曲线。

1.4 数据分析采用隶属函数法对不同非生物胁迫处理进行综合评价,获得最优处理方式。计算公式如下:

隶属函数值:

U(Xij)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(3)

反隶属函数值:

U(Xij)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(4)

式中:U(Xij)为i处理j代谢物含量的隶属函数值;Xij为i处理j代谢物含量的测定值;Xmin、Xmax为所有处理中某一代谢物含量的最小值和最大值。

2 结果与分析

2.1 不同胁迫对金龙胆草皂苷含量的影响从图1可以看出,经过不同胁迫处理后金龙胆草皂苷含量均呈上升趋势,其中紫外胁迫后含量上升最明显,在胁迫24 h是对照(CK)的1.36倍,48 h是CK的2.06倍。其次为低温胁迫,胁迫24和48 h皂苷含量分别为CK的1.34和2.05倍。再者为茉莉酸甲酯处理,胁迫24和48 h皂苷含量分别为CK的1.29和1.69倍。干旱胁迫和高盐胁迫作用不明显,干旱处理10 d皂苷含量增加了1.18倍,15 d增加了1.21倍,而高盐处理24 h是CK的1.05倍,48 h是CK的1.34倍。因此不同处理对金龙胆草皂苷含量的影响从大到小依次为紫外>低温>茉莉酸甲酯>高盐>干旱。

注:不同小写字母表示同一处理不同时间之间差异显著(P<0.05)。

2.2 不同胁迫对金龙胆草苦蒿素含量的影响从图2可以看出,对苦蒿素含量影响最大的处理也为紫外胁迫,与CK相比,胁迫24 h苦蒿素含量增加了0.23倍,48 h增加了0.43倍。其次为高盐胁迫,胁迫24 h苦蒿素含量增加了0.04倍,48 h增加了0.27倍。低温胁迫与高盐胁迫对苦蒿素含量的影响相差不大,胁迫48 h苦蒿素含量增加了0.26倍。再者为茉莉酸甲酯处理,与CK相比,处理24 h苦蒿素含量增加了0.11倍,48 h增加了0.19倍。影响最小的胁迫为干旱,干旱胁迫10 d苦蒿素含量仅增加了0.03倍,15 d增加了0.06倍。因此不同处理对金龙胆草苦蒿素含量的影响从大到小依次为紫外>高盐>低温>茉莉酸甲酯>干旱。

注:不同小写字母表示同一处理不同时间之间差异显著(P<0.05)。

2.3 不同胁迫对金龙胆草黄酮含量的影响从图3可以看出,各非生物胁迫对黄酮含量的影响均呈升高趋势,其中茉莉酸甲酯处理作用最明显,处理24 h黄酮含量增加了2.95倍,48 h增加了3.68倍。干旱胁迫10 d黄酮含量增加了1.04倍,15 d增加了3.33倍。低温胁迫仅次于干旱胁迫,胁迫48 h金龙胆草黄酮含量增加了3.02倍。高盐和紫外胁迫对黄酮含量的影响较小,胁迫24 h黄酮含量分别增加了1.27和1.21倍,48 h黄酮含量分别增加了1.33和1.85倍。因此不同处理对金龙胆草黄酮含量的影响从大到小依次为茉莉酸甲酯>干旱>低温>紫外>高盐。

注:不同小写字母表示同一处理不同时间之间差异显著(P<0.05)。

2.4 不同非生物胁迫下金龙胆草主要化合物含量隶属函数分析选择各胁迫处理48 h/15 d的次生代谢物含量数据,利用模糊隶属函数,计算各胁迫综合隶属值。根据隶属函数平均值的大小确定最优胁迫方式。由表1可知,各胁迫处理的效果由强到弱依次为紫外>茉莉酸甲酯>低温>高盐>干旱。

表1 不同非生物胁迫下次生代谢物含量隶属函数值

3 结论与讨论

研究表明药用植物的药理作用主要与次生代谢物有关,且当其受到环境胁迫时可通过积累次生代谢物提高自我保护和生存竞争能力。因此研究其与环境的关系,对药用植株栽培过程中控制有关成分的合成和积累具有指导意义。皂苷、苦蒿素、黄酮为药用植物金龙胆草的主要有效成分,提高它们的含量可获得高品质的金龙胆草药材。次生代谢物的积累需要环境因子的诱导,可诱导或影响次生代谢产物合成积累的环境因子很多,例如个体密度和病虫害的侵袭等生物因子,以及水分、温度、紫外线、外源激素、土壤理化性质等非生物因子[14-15]。各类非生物因子通过激活信号分子,诱导转录因子转录,从而促进一系列关键酶基因的表达,最终调节次生代谢物的合成。

基于此,该研究探讨了盐胁迫、低温胁迫、干旱胁迫、紫外胁迫及外源激素诱导对皂苷、苦蒿素、黄酮含量的影响,结果发现在各类胁迫下,3种次生代谢物含量均呈增加趋势。其中紫外胁迫对金龙胆草皂苷和苦蒿素的作用最大,两者皆为萜类衍生物。Zhan等[16]研究表明,在紫外胁迫下金龙胆草抗氧化能力提高,同时部分转运蛋白基因表现为上调,这些条件有利于苦蒿素的积累。党悦方[17]研究UV-B辐射对夏枯草成分含量的影响,结果表明,UV-B对齐墩果酸和熊果酸的含量均有促进作用。该研究表明对黄酮含量影响最明显的是茉莉酸甲酯处理,雒晓鹏等[18]和王旭云等[19]均研究发现茉莉酸甲酯对植物黄酮含量有明显促进作用。

综上所述,非生物胁迫对金龙胆草次生代谢物含量有促进作用,可以利用适当的胁迫手段获得高次生代谢物含量的金龙胆草植株,为高品质金龙胆草的培育提供一定的参考,对金龙胆草药物的开发具有促进作用。在此基础上,未来可对其胁迫响应机制进一步研究,获得关键转录因子和酶基因,调控次生代谢物的合成。