中华绒螯蟹养殖用抑水绵枯草芽孢杆菌A4的安全性分析

曹海鹏，顾 颖，，孙苗苗，王会聪，叶仁智，安 健

(1.上海海洋大学，国家水生动物病原库，上海 201306；2.上海海洋大学，上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306；3.连云港市海洋与渔业发展促进中心，江苏连云港 222000；4.江苏农林职业技术学院，江苏句容 212400)

近年来，商品化益生菌制剂在水产养殖应用中的安全性问题日益突出。相关研究表明，部分市售益生菌株含有肠毒素基因、呕吐毒素基因和溶血素，能引起脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)死亡以及克氏原螯虾(Procambarusclarkia)肠炎、中华鳖(Pelodiscussinensis)“摇头症”、黄沙鳖(P.sinensis)疥疮病和腐皮病[1-6]。因此，水产用益生菌的安全性评价必须予以重视。目前，水产用功能芽孢杆菌的安全性研究工作已取得了较大进展。安健等[12]通过耐药性、毒力基因检测和对小鼠(Musmuslulus)及草鱼(Ctenopharyngodonidellus)的致病性评价了解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)G1的安全性，证实解淀粉芽孢杆菌G1对小鼠和草鱼的LD50大于109CFU/g，为无毒菌株；王琳晶等[13]通过溶血和对斑马鱼(Daniorerio)的致病性分析评价了解淀粉芽孢杆菌ZJ2009的安全性，证实解淀粉芽孢杆菌ZJ2009无溶血活性，对斑马鱼无毒；周敏等[14]通过溶血和对尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)的致病性分析评价了大山芽孢杆菌(B.gaemokensis)JY-1的安全性，证实大山芽孢杆菌JY-1无溶血活性，对尼罗罗非鱼无致病性。

水绵是一种在水产养殖环境中广泛存在的有害丝状绿藻，易导致中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)脱壳困难、窒息或中毒甚至死亡，严重影响了中华绒螯蟹养殖业的发展[7-9]。目前，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophic)和侧孢芽孢杆菌(B.licheniformis)的一些菌株被证实具有抑制水绵的效果[10-11]。然而，关于抑水绵芽孢杆菌的安全性评价却鲜有报道。鉴此，本实验参照《HJ/T 415-2008 环保用微生物菌剂环境安全评价导则》、《GB 20287-2006 农用微生物菌剂》、《NY/T 1444-2007 微生物饲料添加剂技术通则》和《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》等相关标准，从溶血性、有害代谢物产生能力、耐药性与耐药质粒及其对斑马鱼、大型蚤、中华绒螯蟹的毒性对抑水绵枯草芽孢杆菌A4的安全性进行了检测分析，以期为枯草芽孢杆菌A4在中华绒螯蟹养殖中的应用奠定安全性依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

斑马鱼平均体质量(0.3±0.05)g，健康无病伤，由上海海洋大学鱼类学实验室提供；大型蚤(Daphniamagna)由上海海洋大学水生生物学实验室提供；中华绒螯蟹，平均体质量(30.0±3.1)g，健康无病伤，由江苏连云港某养殖场提供；抑水绵枯草芽孢杆菌A4，分离自池塘底泥，由本实验室分离保藏[15]；益生地衣芽孢杆菌BYK，由上海海洋大学水生动物病原库提供；营养琼脂、营养肉汤，购自国药集团化学试剂有限公司；DNA marker、2×Taq PCR Master Mix和4S Green Plus核酸染料，购于上海生工生物工程技术服务有限公司；6×DNA Loading Buffer，购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖，购自美国海普生物公司；哥伦比亚血琼脂平板，购自南京全隆生物技术有限公司；蛋白胨水(色氨酸肉汤)生化鉴定管、尿素酶生化鉴定管、硫化氢生化鉴定管，购于青岛海博生物有限公司；鸟氨酸脱羧酶生化鉴定管、赖氨酸脱羧酶生化鉴定管、精氨酸脱羧酶生化鉴定管、氨基酸脱羧酶对照生化鉴定管、无菌液体石蜡、Kovacs靛基质试剂，购自广东环凯微生物科技有限公司；药敏纸片，购自杭州滨河微生物试剂有限公司；质粒小量提取试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；标准稀释水，参照《GB /T 13267-1991水质 物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》自制。

1.2 枯草芽孢杆菌A4菌悬液的制备

参照黄晓东等[16]的方法将枯草芽孢杆菌A4接种到无菌营养肉汤中，于30 ℃、200 r/min的条件下培养24 h 后12 000 r/min 离心10 min，弃上清，用无菌生理盐水重悬菌沉淀，制成浓度为1.5×1010CFU/mL的菌悬液。

1.3 枯草芽孢杆菌A4的毒力基因检测

参照范培超等[17]的方法对枯草芽孢杆菌A4中肠毒素基因(nheA、bceT和entFM)、呕吐基因(ces)、细胞毒素基因(cytK)和溶血素基因(hblA、hblC和hblD)等8种常见的芽孢杆菌毒力基因进行PCR检测。PCR扩增引物由上海迈浦生物科技有限公司合成，引物信息见表1。PCR反应体系为25 μL，包括2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板2 μL，引物各1 μL，dd H2O 8.5 μL。PCR反应条件为：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s，退火30 s(退火温度见表1)，72 ℃，30 s，共35个循环；72 ℃，10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。以地衣芽孢杆菌 BYK为对照。

表1 毒力基因引物信息Tab.1 Primers for virulence genes

1.4 枯草芽孢杆菌A4有毒有害产物产生能力检测

1.4.1 溶血能力检测

参照陈书畅等[19]的方法将枯草芽孢杆菌A4接种于哥伦比亚血琼脂平板，37 ℃培养24 h后，观察菌落周围是否产生溶血圈。若无溶血圈产生，则为γ-溶血；产生绿色溶血圈，则为α-溶血；产生透明溶血圈，则为β-溶血[20]。每个处理3个平行。

1.4.2 有害产物产生能力检测

采用生化鉴定管法[21]检测枯草芽孢杆菌A4对生物胺、吲哚、氨和硫化氢等有害产物的产生能力。每个处理3个平行。

1.5 枯草芽孢杆菌A4的耐药性检测

采用纸片扩散法[1]检测枯草芽孢杆菌A4对30种抗生素的敏感性。即无菌操作取100 μL枯草芽孢杆菌A4的菌悬液涂布于营养琼脂平板上，然后立即将抗生素纸片贴于营养琼脂平板上，30 ℃培养24 h后测量抑菌圈直径，并根据CLSI药敏试验判定标准[22]判断枯草芽孢杆菌A4的药物敏感性。每个处理3个平行。

1.6 枯草芽孢杆菌A4的耐药基因检测

参照沈飞等[23]的方法对枯草芽孢杆菌A4的多肽类耐药基因(MCR-1)、酰胺醇类耐药基因(floR)、氨基糖苷类耐药基因(aph(3′)-Ⅰa和aac(6′)-Ⅰb)、β-内酰胺酶类耐药基因(blaTEM和blaCTX)、大环内酯类耐药基因(ermA和ermC)、喹诺酮类耐药基因(qnrA和qnrB)、磺胺类耐药基因(sul1和sul2)和四环素类耐药基因(tetA和tetM)等14种耐药基因进行PCR检测。PCR扩增引物由上海迈浦生物科技有限公司合成，引物信息见表2。PCR扩增条件为：94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃，10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。以地衣芽孢杆菌 BYK为对照。

表2 耐药基因引物信息Tab.2 Primers for resistance genes

1.7 枯草芽孢杆菌A4的耐药质粒检测

参照甘永琦等[31]的方法采用质粒小量提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌A4的质粒，以地衣芽孢杆菌BYK为对照，取5 μL的质粒提取液中加入1 μL 6×上样缓冲液，点样于0.7%琼脂糖凝胶孔道中进行电泳，电泳结束后，用凝胶成像系统观察琼脂糖凝胶是否出现质粒条带。

1.8 枯草芽孢杆菌A4对水生动物的毒性分析

1.8.1 枯草芽孢杆菌A4对斑马鱼的毒性

参照NI等[32]的方法。实验设置6个实验组和1对照组，每组3个平行玻璃水族缸，每个水族缸分别盛有1 L曝气自来水并放入健康斑马鱼10尾。实验组水族缸加入枯草芽孢杆菌A4菌悬液至终浓度分别为 1.5×104、1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108、1.5×109CFU/mL，每天更换实验水至实验浓度；对照组不加任何物质。连续观察7 d并记录鱼体反应能力、游动能力和呼吸能力等，以及各组斑马鱼的死亡数目，采用BLISS法[33]计算枯草芽孢杆菌A4对斑马鱼的半数致死浓度(LC50)。将水质条件控制在22～24 ℃、DO>4 mg/L、pH 7.0～7.5。

1.8.2 枯草芽孢杆菌A4对大型蚤的毒性

参照朱碧云等[34]的方法。实验设置6个试验组和1对照组，每组3个平行玻璃烧杯，每个烧杯分别盛有100 mL标准稀释水并放入健康大型蚤10只。实验组烧杯加入枯草芽孢杆菌A4菌悬液至终浓度分别为 1.5×104、1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108、1.5×109CFU/mL，每天更换实验水至试验浓度；对照组不加任何物质。连续48 h观察并记录大型蚤活动受抑制数和中毒症状。实验期间光照周期(光照/黑暗)为12 h/12 h，将水质条件控制在水温24～26 ℃、DO 8～9 mg/L、pH 7.5～8.5。

1.8.3 枯草芽孢杆菌A4对中华绒螯蟹的毒性

参照周丽颖等[35]的方法。实验包括6个试验组和1对照组，每组3个平行塑料水族缸，每个水族缸分别盛有60 L曝气自来水并放入健康中华绒螯蟹10只。实验组中华绒螯蟹分别在第三步足基部注射100 μL浓度为 1.5×104、1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108、1.5×109CFU/mL的枯草芽孢杆菌A4菌悬液，对照组注射100 μL生理盐水。连续7 d观察中华绒螯蟹有无摄食异常，附肢无力等不正常行为，并记录各组中华绒螯蟹的死亡数目。采用BLISS法计算枯草芽孢杆菌A4对中华绒螯蟹的半数致死浓度(LC50)。实验期间水质条件控制在24～26 ℃、DO>6 mg/L、pH 7.5～8.0。

1.9 数据分析方法

实验数据以平均值±标准差(Mean ± SD)表示，采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 枯草芽孢杆菌A4的毒力基因

实验结果(图1)表明，枯草芽孢杆菌A4不携带nheA、bceT、ces、cytK、entFM、hblA、hblC和hblD等8种毒力基因，而对照菌株BYK含bceT和hblA毒力基因，不携带nheA、ces、cytK、entFM、hblC和hblD等6种毒力基因。

图1 枯草芽孢杆菌A4毒力基因的PCR检测结果Fig.1 PCR detection of virulence genes from B.subtilis A4M：DL2 000 DNA marker；1-8：A4 nheA、bceT、entFM、ces、cytK、hblA、hblC和hblD毒力基因；9-16：BYK nheA、bceT、entFM、 ces、cytK、hblA、hblC和hblD毒力基因。

2.2 枯草芽孢杆菌A4有毒有害产物的产生能力

实验结果表明，枯草芽孢杆菌A4无溶血活性，也不产生腐胺、尸胺、精胺、吲哚以及氨、硫化氢等有害代谢物。

2.3 枯草芽孢杆菌A4的耐药性

实验结果(表3)表明，枯草芽孢杆菌A4对苯唑西林、氨苄西林、羧苄西林、哌拉西林、头孢氨苄、头孢唑林、头孢拉定、头孢呋辛、头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、四环素、多西环素、米诺环素、麦迪霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、万古霉素、多粘菌素B、复方新诺明、呋喃唑酮、氟苯尼考、氯霉素和克林霉素等30种抗生素均高度敏感。

表3 枯草芽孢杆菌A4的药敏特性Tab.3 Antibiotic sensitivity of B.subtilis A4

2.4 枯草芽孢杆菌A4的耐药基因检测

实验结果(图2)表明，枯草芽孢杆菌A4携带氨基糖苷类耐药基因aph(3′)-Ⅰa和β-内酰胺酶类耐药基因blaTEM，不携带多肽类耐药基因(MCR-1)、酰胺醇类耐药基因(floR)、氨基糖苷类耐药基因(aac(6′)-Ⅰb)、β-内酰胺酶类耐药基因(blaCTX)、大环内酯类耐药基因(ermA和ermC)、喹诺酮类耐药基因(qnrA和qnrB)、磺胺类耐药基因(sul1和sul2)和四环素类耐药基因(tetA和tetM)等12种耐药基因，而对照菌株BYK携带floR、aph(3′)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb和blaTEM等4种耐药基因，不携带MCR-1、blaCTX、ermA、ermC、qnrA、qnrB、sul1、sul2、tetA和tetM等10种耐药基因。

图2 枯草芽孢杆菌A4耐药基因的PCR检测结果Fig.2 PCR detection of resistance genes from B.subtilis A4M：DL2 000 DNA marker；1-14：A4 MCR-1、floR、aph(3′)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb、blaTEM、blaCTX、ermA、ermC、qnrA、qnrB、sul1、sul2、tetA和tetM耐药基因；15-28：BYK MCR-1、floR、aph(3′)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb、blaTEM、blaCTX、ermA、ermC、qnrA、qnrB、sul1、sul2、tetA和tetM耐药基因。

2.5 枯草芽孢杆菌A4的耐药质粒检测

实验结果(图3)表明，枯草芽孢杆菌A4不含质粒，不存在耐药质粒转移的风险，而对照菌株BYK含有质粒，具有耐药质粒转移的风险。

图3 枯草芽孢杆菌A4质粒检测Fig.3 Detection of plasmids from B.subtilis A4M：DL15 000 DNA marker；1：枯草芽孢杆菌A4；2：地衣芽孢杆菌BYK。

2.6 枯草芽孢杆菌A4对水生动物的毒性

实验结果表明，对照组和6个枯草芽孢杆菌A4处理组的斑马鱼均生长良好，未出现反应迟缓和鱼体侧翻等任何异常症状和死亡，而且对照组和6个枯草芽孢杆菌A4处理组的大型蚤也生长良好，未出现反应迟缓等中毒症状和死亡。此外，对照组和6个枯草芽孢杆菌A4处理组的中华绒螯蟹均未出现死亡，而且生长良好、摄食正常，未出现附肢无力等任何异常症状。由此说明，枯草芽孢杆菌A4对斑马鱼、大型蚤和中华绒螯蟹的LC50均大于1.5×109CFU/mL。

3 讨论

3.1 枯草芽孢杆菌A4的毒力基因分布

毒力基因检测是评价芽孢杆菌安全性的指标之一[1]。据报道，芽孢杆菌可能含有溶血素Hbl基因(hblA、hblC和hblD)、非溶血性肠毒素Nhe基因(nheA、nheB和nheC)、细胞毒素K基因(CytK)、 肠毒素T基因(bceT)、肠毒素FM基因(entFM)等肠毒素基因和呕吐素基因(ces)，具有产生溶血性、肠毒素和呕吐毒素的潜力，与芽孢杆菌的致病性密切相关[36]。例如，携带溶血素Hbl基因、细胞毒素K基因和肠毒素T基因的蜡状芽孢杆菌能够引起半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)出现皮肤溃烂、充血、淤血等病症[37]。因此，枯草芽孢杆菌的肠毒素和呕吐毒素基因检测至关重要。刘纯等[1]研究发现，枯草芽孢杆菌S-1不携带hblA、hblB、hblC、nheA、nheB、bceT和ces等肠毒素和呕吐毒素基因，但携带hblD、nheC和cytK等3种毒力基因；枯草芽孢杆菌S-2不携带hblA、hblB、hblC、nheA、nheB、nheC、cytK、bceT和ces等肠毒素和呕吐毒素基因，但携带肠毒素基因hblD；SOROKULOVA等[38]研究表明枯草芽孢杆菌BS3不携带hblA、hblB、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、bceT和cytK等肠毒素和呕吐毒素基因。本实验发现枯草芽孢杆菌A4不携带nheA、bceT、ces、cytK、entFM、hblA、hblC和hblD等肠毒素和呕吐毒素基因，与刘纯等[1]、SOROKULOVA等[38]的报道有所不同，可能是因为不同分离源的枯草芽孢杆菌菌株的毒力基因具有较大的遗传多样性。

3.2 枯草芽孢杆菌A4有毒有害代谢产物的产生能力

溶血素是致病芽孢杆菌重要的毒力因子，其作用于细胞膜后会造成其结构和功能紊乱，导致细胞死亡，引起严重的细菌性疾病，严重危害养殖动物的健康[17，39]。因此，溶血素产生是评价功能性芽孢杆菌安全性的重要检测指标之一。陈丰等[40]研究发现，蜡样芽孢杆菌CS4具有β-溶血性，对鲫的LD50为4.6×106CFU/g，能导致鲫体表充血、腹腔内严重出血等症状；郭艺伟等[41]研究表明，贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)Y1无溶血性，在菌浓度为1.0×108CFU/mL时饲喂小鼠，对小鼠无致病性。本实验发现，枯草芽孢杆菌A4无溶血性，与郭艺伟等[41]的报道相同。此外，致病性芽孢杆菌能够产生生物胺和吲哚等有害物质，引起免疫、消化和神经系统功能障碍[39]。张艳等[21]研究发现，枯草芽孢杆菌LLYB不产生生物胺和吲哚。本实验也证实枯草芽孢杆菌A4不产生腐胺、精胺、尸胺和吲哚，与张艳等[21]报道的枯草芽孢杆菌LLYB在生物胺和吲哚产生上的研究结果一致。

3.3 枯草芽孢杆菌A4的耐药性

枯草芽孢杆菌的耐药性已成为全球关注的问题，其抗生素耐药基因能够通过耐药质粒在环境中发生转移[42]。因此，检测枯草芽孢杆菌的耐药性及其耐药质粒已成为评价其安全性的重要内容。樊丹等[43]研究表明，枯草芽孢杆菌RT-BS07对环丙沙星、氧氟沙星和链霉素等18种抗生素高度敏感，但对呋喃唑酮耐药；SOROKULOVA等[38]研究表明，枯草芽孢杆菌BS3对氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、新霉素、克林霉素、四环素、甲氧苄氨嘧啶、环丙沙星和恩诺沙星等抗生素高度敏感，对氯霉素、头孢曲松等抗生素中度敏感，对苯唑西林耐药，且不携带质粒。本实验发现，枯草芽孢杆菌A4对30种常见抗生素均高度敏感，不携带MCR-1、floR、aac(6′)-Ⅰb、blaCTX、ermA、ermC、qnrA、qnrB、sul1、sul2、tetA和tetM等12种耐药基因，与耐药表型一致，但枯草芽孢杆菌A4携带aph(3′)-Ⅰa和blaTEM耐药基因，与耐药表型不一致，可能是检测到的耐药基因未能表达转化为具有生物活性的蛋白质分子[44]。此外，枯草芽孢杆菌A4未检测到耐药质粒，表明枯草芽孢杆菌耐药基因不是由质粒编码，其所携带aph(3′)-Ⅰa和blaTEM耐药基因属于固有抗性基因，耐药性不具有通过质粒转移的可能性[28]。

3.4 枯草芽孢杆菌A4的安全性

张洪玉等[45]实验发现蜡样芽孢杆菌D7对斑马鱼和大型蚤的LC50>108CFU/mL，且对斑马鱼、大型蚤安全无毒；黄晓东等[16]实验发现地衣芽孢杆菌PNB3对斑马鱼的LC50>2.0×108CFU/mL，且对斑马鱼安全无毒；王琳晶等[13]实验表明解淀粉芽孢杆菌ZJ2009对斑马鱼LC50>108CFU/mL，且对斑马鱼安全、无毒副作用。本实验结果表明，枯草芽孢杆菌A4对斑马鱼、大型蚤的LC50>1.5×109CFU/mL，其LC50比芽孢杆菌D7、PNB3和ZJ2009等菌株的LC50更高，说明更具安全性。此外，枯草芽孢杆菌A4对中华绒螯蟹的LC50>1.5×109CFU/mL。根据MITTAL等[46]对菌株毒力的判定标准，可判定枯草芽孢杆菌A4为无毒菌株。因此，枯草芽孢杆菌A4在中华绒螯蟹养殖中具有良好的应用安全性。