食品中金黄葡萄球菌的检测方法研究

徐爱民，郭国栋，何晓军

（菏泽市食品药品检验检测研究院，山东菏泽 274000）

金黄葡萄球菌是革兰阳性菌，广泛存在于空气、水体、人与动物的排泄物中，很容易污染肉、蛋、奶等食物。其引起的食物中毒现象，是一个世界性的卫生问题[1]。近年来，随着人们生活节奏的加快，快餐成为一种常见的用餐方式，与此同时人们更加关注食品安全问题。根据不同的食品种类，选择合适的检测技术方法，既能保证检测结果的准确性，又能提高效率、有效控制成本，是从业人员的重要研究课题。本文结合笔者实践经验和现有研究成果，对食品中金黄葡萄球菌的检测方法进行综述。

1 金黄葡萄球菌概述

1.1 金黄葡萄球菌的特点

金黄葡萄球菌多为球状或椭圆状，一般聚集排列成葡萄串，可产生黄色的脂溶性色素。它对热、盐、干燥均有较强的抵抗能力，在80 ℃下可存活 30 min，在10%的氯化钠溶液中可长期存活并繁殖，在干燥的脓液、痰液中可存活2 ～3 个月。金黄葡萄球菌一般分为A、B、C、D、E 这5 个类型，以A型肠毒素引起的中毒最为多见[2]。

1.2 金黄葡萄球菌的危害

正常情况下，机体可在一定程度上抵抗金黄葡萄球菌感染；但当皮肤黏膜受损、机体免疫力降低时，病原侵入机体就会产生危害。一类是侵袭性疾病，以组织感染为特征，常见如皮肤感染、伤口化脓、内脏器官感染、败血症等。另一类是毒素性疾病，以食物中毒、毒素休克综合征为特征，常见如急性胃肠炎、高热、腹泻、皮疹等。对此，《食品安全国家标准 食品中致病菌限量》（GB 29921——2013）中，明确规定了金黄葡萄球菌在8 大类食品中的检测限量。

1.3 金黄葡萄球菌的耐药性

随着细菌感染引起的疾病越来越多，临床上对于抗生素的使用不合理，导致耐药性的产生。相关研究证实，金黄葡萄球菌对多种抗生素具有耐药性，较为常见且严重的是耐甲氧西林金黄葡萄球菌、耐万古霉素金黄葡萄球菌[3]。

2 传统培养法在食品中金黄葡萄球菌检测中的应用

《食品安全国家标准 食品微生物学检 金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10——2016）中规定传统培养法是金黄葡萄球菌检测的国家强制标准，可实现定性与定量检测。该方法虽然成本低廉，但检验操作复杂，整个检验周期长，需要5 d 左右才能得到检验结果。区楚君等[4]以冷冻肉及肉制品为对象，针对传统培养法受杂菌干扰导致假阴性较高的问题，对分离方法进行改进，结果发现金黄色葡萄球菌的分离率从2.61%提高至19.98%，有效避免了假阴性现象的发生。

3 免疫学方法在食品中金黄葡萄球菌检测中的应用

3.1 乳胶凝集试验

乳胶凝集试验是使用有抗体的彩色乳胶颗粒，对金黄葡萄球菌细胞悬液进行检测，若悬液中有特异性抗原，就会发生凝集或沉淀。该试验方法的优点是操作简单、反应快速，缺点是灵敏度不高，需在检测前进行增菌处理。以法国生物梅里埃公司为例，对样品进行24 h 增菌处理，只需20 s 就能得到阳性或阴性结果。

3.2 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法在食品检测领域的适用范围广、技术成熟。其原理是利用固相载体上的抗体，捕捉样本中的抗原，加入酶标抗体后，形成抗体-抗原-抗体复合物；最后加入显色底物反应后，用肉眼观察并使用酶标仪判定。该方法的灵敏度不高，需在检测前进行增菌处理。时玉菲等[5]针对金黄色葡萄球菌A 型肠毒素，使用单克隆抗体作为捕获抗体，抗SEA 兔多抗血清作为检测抗体，建立双抗体夹心酶联免疫吸附法，检测下限为1.89 μg·L-1，回收率为94%～114%，变异系数小于10%。

3.3 免疫层析检测

免疫层析检测利用毛细原理，在硝酸纤维素膜上固定抗体，干燥的硝酸纤维素一端浸入样品溶液中，样品沿着毛细管移动，移动至固定有抗体的区域时，样品中的抗原与抗体发生特异性结合，根据颜色变化达到特异性检测目标。该方法的检测速度快，结果准确性较高。布日额等[6]建立牛乳中金黄色葡萄球菌的胶体金免疫层析检测方法，结果显示最低检出限为1.0×105CFU·mL-1，分离鉴定符合率在83.3%～90.0%，具有操作简单、快捷、稳定等优点。

4 分子生物学在食品中金黄葡萄球菌检测中的应用

4.1 PCR 技术

PCR 即聚合酶链式反应，具有快速、灵敏度高、特异性好的优点。由于食品成分较为复杂，加工过程中可能破坏DNA，限制了该技术的应用。对此，通过技术创新可弥补这一缺陷，如实时荧光定量PCR、微滴式数字PCR、多重PCR 等。滕要辉等[7]以速冻食品为对象，针对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌建立了多重PCR 检测方法，结果特异性为100%，可检出菌落数低于100 CFU·g-1的菌群。

4.2 LAMP 技术

LAMP 即DNA 环介导等温扩增技术，适用于基因诊断，显著特点是反应时间短、灵敏度高。郭建平等[8]采用LAMP 技术，基于颜色判定对金黄色葡萄球菌进行检测，结果表明基因组灵敏度达到 0.01 fg·μL-1，菌落灵敏度达到1.9 CFU·mL-1，不仅可靠性和特异性良好，而且不需要特殊设备。

4.3 RPA 技术

RPA 即重组酶聚合酶恒温扩增技术，它主要依赖于3 种酶：①能与单链核酸结合的重组酶；②链置换DNA 聚合酶；③单链DNA 结合蛋白，最佳反应温度是37 ℃。该检测技术的优点包括：①常温下检测，不需要热循环，对仪器设备要求低；②仅需少量核酸分子，在3 ～10 min 即可完成检测任务，且一个人就能完成操作过程；③能在同一个管中，同时进行多个扩增反应；④灵敏度高，可满足定量检测要求。在市场应用方面，英国TwistDX 公司研发的TwistAmp 产品，可在常温下完成检测，用时在15 min 以内，尤其适用于食品安全、生物安全、体外诊断、兽医以及农业等领域[9]。

4.4 SAT 技术

SAT 即实时荧光核酸恒温扩增技术，它的标靶和扩增产物均是RNA，整个反应时间较短，荧光信号经荧光检测仪器实时捕获，可实时反映扩增循环情况。李桂金等[10]采用SAT 法检测食品中的金黄色葡萄球菌，并对检测能力进行评价，结果显示纯培养物检出限为103CFU·mL-1，灵敏度为100%，假阴性率为0%，假阳性率为2.9%，各项结果均达标。

4.5 核酸探针技术

核酸探针技术利用核苷酸碱基顺序互补的原理，对DNA 或RNA 片段进行标记，检测样本中某个特定微生物的核苷酸顺序。不同微生物的基因序列不同，因此该检测技术具有先进性。然而，食品中金黄葡萄球菌的含量少，一般不直接采用核酸探针检查，目前只有少数公司在研究推广该技术。例如，美国GEN-Probe 公司研制的AccuProbe 试剂，可在72 h 内对食品中的金黄葡萄球菌进行检测。

5 快速检测法在食品中金黄葡萄球菌检测中的应用

传统培养法是金黄葡萄球菌检测的国家强制标准，可实现定性与定量检测。但是，食品检测具有工作量大、范围广的特点，传统培养法在操作方法和检测周期上不具有优势，不能满足实际检测需求。对此，相关企业和从业人员对传统培养法进行优化改良，形成快速检测技术，以显色培养基法、鉴别培养基法、纸片法为代表，具有操作简单、成本低廉、快速准确的优点。

5.1 显色培养基法

显色培养基法是利用微生物自身代谢产生的酶，加入显色底物后反应显色实现检测效果，在特异性酶的作用下，通过观察菌落的颜色对菌种进行鉴定，其特异性和灵敏度均高于传统培养法。周霞霞等[11]对金黄色葡萄球菌标准菌株、食品样本分离菌株采用显色培养基进行检验，并与国标法、微生物鉴定药敏分析系统的检验结果进行比较，结果显示显色培养基能快速锁定疑似目标菌落，定量检测与其他方法在计数值上无显著性差异。

5.2 鉴别培养基法

鉴别培养基法是在培养基中加入试剂或化学药品，不同微生物对这些成分的分解能力不同，指示剂对不同菌落显示不同颜色，达到鉴别与区分的效果。法国生物梅里埃公司研制的Baird Parket+RPF 培养基，加入兔血浆，在37 ℃下培养24 h，得到不透明的菌落即是金黄色葡萄球菌。仇华磊等[12]以导致奶牛发生乳腺炎的金黄色葡萄球菌为对象，在Bairdparker 培养基的基础上选择mBP 培养液，根据培养液是否浑浊、产生黑色物质，判断奶样中金黄色葡萄球菌对所试抗生素的敏感性。该方法简单、快速，不需使用专门的设备，具有较高推广价值。

5.3 纸片法

美国3M 公司生产的第2 代金黄色葡萄球菌快速检测纸片，检测过程包括两个阶段：第一阶段使用改良后的B-P 培养基，含有金黄色葡萄球菌的样本培养24 h 后，在纸片上呈现为暗紫色；第二阶段若呈现为其他颜色，就使用含有显色剂和DNA 的确认反应片，1 ～3 h 后金黄色葡萄球菌形成粉红色环，其他菌落不会形成，作为鉴别判断依据。孙鑫泽等[13]的研究中，以乳制品、熟肉制品和方便食品为对象，对比纸片法和B-P 平板法对金黄色葡萄球菌的检出率和用时，结果显示两种方法的检出率无明显差异，但纸片法检测用时明显缩短。

此外还有其他检测技术，如生物素标记法、鲁米诺信号化学发光法、BAX Q7 全自动病原菌检测系统等[14]。

6 结语

综上所述，食品卫生安全直接关系到人体健康，金黄葡萄球菌检测一直是食品检测的一个重要项目。文章以传统培养法、免疫学方法、分子生物学、快速检测法为例，阐述了其在金黄葡萄球菌检测中的应用现状。未来，快速检测技术因操作简单、成本低廉、方便快捷的优点，具有良好的市场发展前景，将会成为一个重点发展方向。