Hantzsch合成法和氰基缩合法制备Boc-甘氨酸噻唑乙酯比较

任德豪,赵湲湲,高庆英,伊海晨,罗涛,刘义

(烟台大学 化学化工学院,山东 烟台 264006)

噻唑是一种典型的五元杂环类化合物。噻唑环中含有一个硫原子和氮原子,可以通过氢键、弱相互作用、螯合等方式与蛋白质、DNA、RNA、金属离子及其他分子相互作用[1]。事实上,噻唑结构不仅在活性天然产物中广泛存在,也在药物开发中扮演了重要作用。如市售抗艾滋病药物——利托那韦[2],分子结构中包含两个噻唑结构,其被发现可以有效地抑制人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)中天冬氨酸蛋白酶的活性。近来,利托那韦被发现也可以用于新冠病毒的杀灭和治疗。噻唑呋林是另一个含有噻唑杂环的市售药物[3],它被发现是一种有效的核苷类似物,可以在体内有效抑制次黄嘌呤核苷酸脱氢酶,进而抑制癌细胞的增殖。噻唑呋林还作为孤儿药物,被用于治疗慢性骨髓性白血病。达沙替尼也是一种含有噻唑结构的抗肿瘤市售药物。达沙替尼是一种重要的酪氨酸激酶抑制剂,在粒细胞白血病治疗中扮演了重要角色。达沙替尼不仅可以有效抑制慢性粒细胞白血病向急性白血病的转化,而且被发现可以有效延长白血病患者的生存期[4]。

噻唑氨基酸作为一种特殊的噻唑化合物,还被发现广泛存在于活性天然产物中。例如:2008年,瑞士科学家 Friedrich Jüttner等人从铜绿微囊藻PCC 7806中分离出了一个名为Aerucyclamide A的环肽类天然产物[5],其分子结构中不仅包含一个甘氨酸衍生的噻唑,还包含一个噁唑啉和一个噻唑啉结构。对Aerucyclamide A的生物活性分析表明,它具有较好的抗疟疾功效,其对恶性疟原虫(K1菌株)的IC50值可以达到0.7 μmol/L。Luesch及其同事于2008年,也报道了一种从美国佛罗里达州海洋蓝藻Symplocasp中分离出一种环肽类天然产物,并命名为Largazole[6]。如图1所示,Largazole结构中除了含有一个缬氨酸残基和一个长链硫酯片段,还含有一个甘氨酸衍生的噻唑片段和一个噻唑啉结构。有研究表明,甘氨酸噻唑片段对Largazole分子内大环结构的刚性保持起到了重要作用。生物活性研究发现,Largazole对乳腺癌细胞株具有优良的杀灭活性,特别是对非转基因小鼠乳腺上皮细胞(NMuMG)的GI50可以达到122 nmol/L。目前,众多以Largazole为模板的新化合物被不断开发出来,其作为新型抗癌药物开发中一个重要潜力分子,受到越来越多的关注。

图1 几个典型的含噻唑市售药物和含噻唑甘氨酸天然产物

从Largazole和Aerucyclamide A的分子结构中,不难发现甘氨酸衍生噻唑结构,是合成目标分子的重要前体和原料。因此,开展甘氨酸衍生噻唑类化合物的合成,对完成Largazole等活性天然产物的合成和新药开发,都具有重要的实际应用价值。目前甘氨酸衍生噻唑类化合物的合成方法主要有:以经典Hantzsch噻唑环化为关键反应的合成路线[7]和以氰基缩合反应为关键反应合成路线[8]。我们在开展Largazole及类似含噻唑天然产物全合成的研究过程中,发现两条合成方法之间存在较大差异,不同路线的选择会进一步影响噻唑产物的合成效率。于是,我们分别通过两条合成路线完成了目标Boc-甘氨酸噻唑乙酯的合成,并对两条合成路线的具体实施方法和优劣进行了比较。该工作可以为含噻唑氨基酸的大规模制备,提供实验参考和技术支持。

1 实验材料及方法

1.1 试剂

布鲁克AVANCE NEO-400M核磁共振波谱仪 (Germany,布鲁克公司);RE2000-旋转蒸发仪(中国,郑州科泰实验设备有限公司);手持式紫外荧光分析仪(中国,上海豫明仪器有限公司);磁力搅拌器(中国,郑州科泰实验设备有限公司);Thermo Scientific Q Exactive-高分辨质谱仪(赛默飞中国科技有限公司)。

1.2 仪器

Boc-甘氨酸(98%,CAS:4530-20-5,上海麦克林试剂有限公司);劳森试剂(Lawesson reagent)(97%,CAS:19172-47-5,中国百灵威科技有限公司);3-溴代丙酮酸乙酯(97%,CAS:70-23-5,中国百灵威科技有限公司);碳酸铯(99%,CAS:534-17-8,上海麦克林生化科技有限公司);三氟乙酸酐(99%,CAS:407-25-0,上海麦克林生化科技有限公司);1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(97%,CAS:6647-22-2,中国百灵威科技有限公司);溴代三氯甲烷(98%,CAS:75-62-7,中国百灵威科技有限公司);碳酸钙、碳酸钾、无水硫酸钠等均购买自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 实验步骤

1.3.1N-Boc-甘酰胺(2)的制备

将875 mg市售Boc-L-甘氨酸(5.0 mmol)与1.06 g HOBt(5.0 mmol)溶于40 mL二氯甲烷中,搅拌至完全溶解后,加入955 mg EDCI(5.0 mmol),常温搅拌30 min后,冰浴冷却至0 ℃,加入15 mL氨水,缓慢升至室温,继续搅拌30 min后,TLC监测反应完毕。后处理向体系中加入饱和氯化铵溶液淬灭反应后二氯甲烷萃取三次,合并有机相,无水硫酸钠干燥,旋干后分离得到718 mg白色固体,产率82.9%。

1.3.2 (2-氨基-2-硫代乙基)氨基甲酸叔丁酯(3)的制备

将4.0 g Boc-L-甘氨酰胺(22.7 mmol)溶于100 mL干燥二氯甲烷中,搅拌至完全溶解后,加入5.3 g劳森试剂(13 mmol),常温搅拌过夜后,TLC监测反应,反应完全后,旋干溶剂,柱色谱分离得到3.0 g黄色固体,产率68.7%。1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:4.01 (s,2H),1.46 (s,9H)。

1.3.3 Boc-甘氨酸噻唑乙酯(5)的制备——Hantzsch噻唑合成法

取190 mg(1.0 mmol)上一步得到的(2-氨基-2-硫代乙基)氨基甲酸叔丁酯溶解到20 mL乙醇中,将3-溴代丙酮酸乙酯181 mg(1.1 mmol)和碳酸钙200 mg(2.0 mmol)依次加入到反应体系中,常温反应过夜,TLC监测反应结束后,加水淬灭反应,常规后处理后柱色谱分离得到白色固体271 mg,产率76%。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ:8.12 (s,1H),4.66 (s,br,1H),4.64 (s,br,1H),4.42 (q,J=7.2 Hz,2H),1.47 (s,9H),1.40 (t,J=7.2 Hz,3H)。

1.3.4 氰基甘氨酸衍生物(6)的制备

将174 mgN-Boc-甘酰胺(1.0 mmol)溶于3 mL THF,加入320 mg吡啶(4.0 mmol),冷却至零度后加入280 μL三氟乙酸酐(2.0 mmol),常温反应搅拌3 h后旋干,加入稀盐酸和乙酸乙酯萃取,合并有机相,无水硫酸钠干燥、过滤、旋干、色谱柱分离得到褐色固体128 mg,产率82.0%。1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:4.00 (s,2H),1.47 (s,9H)。

1.3.5 Boc-甘氨酸噻唑乙酯(5)的制备——氰基缩合法

将156 mg(1.0 mmol)化合物6、300 mg(2.0 mmol)半胱氨酸乙酯和606 mg三乙胺(6.0 mmol)溶解到10 mL甲醇中,加热回流5 h后,TLC监测化合物6消失,旋去溶剂,柱色谱分离得到225 mg 噻唑啉中间体。继续将其溶解在5 mL二氯甲烷中,加入296 mg(1.5 mmol)溴代三氯甲烷和301 mg(2.0 mmol)的1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯,常温反应0.5 h后,旋去溶剂柱色谱分离得到206 mg化合物5,产率72%。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ:8.12 (s,1H),4.66 (s,br,1H),4.64 (s,br,1H),4.42 (q,J=7.2 Hz,2H),1.47 (s,9H),1.40 (t,J=7.2 Hz,3H)。

2 实验结果与讨论

2.1 Hantzsch噻唑合成路线

如图2该路线选取市售Boc-甘氨酸为原料,首先在EDCI/DIPEA的缩合条件下与氨水以83%的产率制备得到Boc-干氨酰胺,实验发现新购氨水更有利于提高反应产率。劳森试剂(Lawesson reagent)制备硫酰胺是制备噻唑前体的重要反应,劳森试剂的添加量和二氯甲烷溶液的水含量都会影响产率,二氯甲烷含水量高,会出现硫代不完全的状况,而且硫代物3具有较强烈的气味,只适合在通风橱完成反应及后处理。尽管重复多次,硫代的产率最高仍只有69%。随后,本课题组对汉斯噻唑形成反应进行了细致的条件优化。本课题组选用了四种无机碱在乙醇做溶剂的条件下,进行了条件摸索(表1),发现碳酸钙会以最高82%的产率得到目标噻唑产物,碳酸铯作为碱的条件下产率会急剧下降,选择碳酸钾作为无机碱的条件下,只得到了合成前体羟基噻唑啉。

表1 Hantzsch噻唑合成条件摸索*

图2 Hantzsch噻唑合成路线

2.2 基于氰基缩合反应的噻唑合成路线

如图3该路线同样选取市售Boc-甘氨酸为原料,在EDCI/DIPEA的同样的缩合条件下与氨水反应得到Boc-干氨酰胺。接着,在三氟乙酸酐和吡啶的共同存在下脱水,以82%的产率制备得到氰基化合物6,本课题组实验发现,该反应体系需要严格的除水处理,水残余会引起大量的原料剩余。氰基底物与半胱氨酸乙酯7在有机碱存在下,加热回流即可制备得到噻唑啉前体,最后经过DBU/BrCCl3氧化即可得到目标噻唑化合物5。氰基与半胱氨酸的缩合是这条路线的关键反应步骤。

图3 氰基缩合噻唑合成路线

如表2所示,本课题组选取了四种有机碱(二异丙基乙基胺、三乙胺、N-甲基吗啉、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯)和无机碱碳酸氢钠的条件对缩合反应进行了摸索,发现碳酸氢钠无论常温或者加热条件下都只得到了痕量的目标噻唑啉产物。强碱1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯同样也没有得到目标产物,分析是强碱加热的条件下引起了半胱氨酸的消除,进而造成了极低的产率结果。大位阻的二异丙基乙基胺和N-甲基吗啉同样效果不佳,只有三乙胺取得了80%的收率。实验中发现,半胱氨酸过量是氰基底物完全转化为噻唑啉的一个关键因素,考虑可能是反应并未进行惰性气体保护,长时间暴露空气的加热条件下,半胱氨酸可能被氧化为胱氨酸,从而无法进行下一步亲核反应得到噻唑啉产物。最后如图3所示,通过DBU/BrCCl3参与的氧化反应,完成了目标噻唑化合物的合成。

表2 氰基缩合反应条件摸索*

2.3 噻唑产物核磁表征及两条合成路线比较

2.3.1 噻唑产物5的核磁氢谱表征

合成化合物的核磁氢谱结果也与文献报道的结果一致[9]。从图4可以看出,获得的噻唑产物纯度良好,选用氘代氯仿作为溶剂,噻唑5-位的氢以单峰的形式出现在化学位移8.12位置,甘氨酸的CH2峰出在4.64～4.66,乙酯结构中的CH2以典型的四重峰的形式出现在4.42,耦合常数为7.2 Hz。叔丁氧羰基的九个氢出现在1.47,而乙酯末端的甲基峰以三重峰,耦合常数7.2 Hz的形式出现在1.40。

图4 噻唑产物5的氢谱

2.3.2 两条合成路线的比较

综合比较两条合成路线,基于汉斯合成法的合成路线从市售Boc-甘氨酸出发,通过三步反应,可以43.5%的总收率得到目标噻唑产物,整条路线除了硫代酰胺产物和劳森试剂气味较大的缺点外,所用试剂价格成本较低、路线较为简捷、产率较好。

同样以甘氨酸为起始原料的氰基缩合路线,则通过线性步骤4步,以49%的总收率得到了目标Boc-甘氨酸衍生噻唑化物5。综合比较发现:这条路线的产率相对汉斯反应合成路线较高,但该反应路线需要使用价格较昂贵的三氟乙酸酐,对反应体系的除水要求较高,合成路线较长且操作相对繁琐。因此,基于汉斯反应的制备路线更适合大规模、工业制备Boc-甘氨酸噻唑及其衍生物。以上结果也将为Largazole等抗癌天然产物中,噻唑氨基酸原料的高效制备提供一定参考。

3 结论

(1)氨基酸衍生噻唑化物在Largazole等抗癌天然产物和药物分子中广泛存在,本论文对两条噻唑氨基酸合成路线进行了合成尝试及比较。

(2)以市售Boc-甘氨酸为原料,通过氨化、硫代、汉斯反应三步反应,以43.5%的总收率得到Boc-甘氨酸衍生的噻唑产物5。同样以市售Boc-甘氨酸为原料,经过氨化、氰基化、缩合和氧化反应4步,以49%的总产率同样完成了目标噻唑化合物5的合成。

(3)对关键汉斯反应和氰基缩合反应的最优条件进行了摸索,最终通过路线比较发现,汉斯合成法路线更简捷、原料价格更低廉、操作更简便,而氰基缩合反应的路线则产率更高。