比较代谢组和转录组学揭示“19香”水稻香气物质组成及其形成途径

刘志涛，梁嘉燕，孔雷蕾，胡晓丹，郑奕雄，白嵩*

（1.仲恺农业工程学院农业与生物学院 广东广州 510230）（2.广东省农业科学院水稻研究所，农业农村部华南优质稻遗传育种实验室（部省共建），广东省水稻育种新技术重点实验室，广东省水稻工程实验室，广东广州 510640）

香气作为优质稻品种重要的品质性状之一，香气浓郁的优质稻米拥有更高的消费吸引力和市场价值。因此，研究香稻的香气物质组成及其形成机制，解析环境对香气物质的影响对香稻品种的选育，以及香稻异地种植后其香气品质的稳定性具有重要意义。

目前已通过气质联用、电子鼻等方法从稻米中鉴定出200多种香气物质[1]，其中2-乙酰基-1-吡咯啉（2-Acetyl-1-Pyrroline，2AP）[2]是研究较多的一种具有爆米花香味的杂环类化合物。此外，有部分气味阈值较低的杂环类化合物，如2-乙酰基-2-噻唑啉、2-甲基呋喃、2-戊基呋喃等也能为稻米香气贡献不同风味[3]。张江丽等[4]从云南地方香稻品种排香沙糯中发现含量较高的挥发性物质是具有果香、草香等风味的己醛和壬醛。Hinge等[5]通过比较香稻与非香稻发育时期的挥发性成分发现，香稻中的庚醛、(E)-2-辛醛、苯乙醛、戊醛、壬醛、(E)-2-壬烯醛等醛类物质含量均高于非香稻。有研究表明醇类物质中的1-己醇和1-丁醇能赋予稻米甜味、花果香等风味[4]，此外在所有水稻品种中具有较高含量的1-辛烯-3-醇，可赋予大米蘑菇和秸秆风味。但印度香米则具有较高含量的己醇[6]。

鉴于不同稻米中各类物质的占比有所差异，香稻的最终风味源于多种挥发性物质的共同作用[7]，而能被人类嗅觉系统感知到的挥发性物质主要来自于氨基酸、脂肪酸和类胡萝卜素等前体物质[8]。如稻米的香气物质来源于氨基酸和脂肪酸的生成代谢途径。研究表明脯氨酸、鸟氨酸和谷氨酸的代谢途径是香稻关键性香气成分2AP的主要来源，其中脯氨酸的酶促反应产生2AP的前体物质吡咯啉-5-羧酸（Pyrroline 5 Carboxylic Acid，P5C），而鸟氨酸和谷氨酸是2AP的重要氮源[9]。芳香族氨基酸苯丙氨酸的代谢可产生气味阈值较低且具有花果香味的风味物质，如苯乙醛、苯乙酸、苯乙醇等物质[10]。脂肪酸在脂氧合酶或者α-和β-氧化酶作用下，产生具有香气的醛、醇、酮和酸类等物质。据研究报道，油酸和亚油酸的分解产物和氧化速度存在差异[11]，因此对两者分解产物的鉴定可用来作为脂质氧化的标记[12,13]。

根据前人研究以及农户调查发现同一香稻品种异地种植后其香气发生显著差异，该变化不利于维持稻米香气品质的稳定性以及香稻品种种植区域的扩大。目前关于香稻香气成分的研究主要集中于对特征性香气成分2-乙酰基-1-吡咯啉（2AP）的合成途径及其潜在的分子调控网络的研究，但其他香气物质的合成通路以及分子遗传机制有待研究和解析。

1 材料与方法

1.1 材料及种植

优质籼型香稻品种“19香”是广东省农业科学院水稻研究所培育的香型丝苗米新品种，是当前广东省各地丝苗米产业园的主栽品种。本实验于2021年早季在广东省龙川市和连山市的水稻育种试验基地种植香稻“19香”，采用人工手插，株行距为20 cm×20 cm，常规水肥管理。于两地稻苗抽穗期时各选取部分长势一致的开花颖壳并用马克笔标记，在花后10 d（乳熟期）采用消毒镊子将标记的籽粒胚乳剥取，存放于无菌2 mL研磨管，剥取过程于液氮条件下完成。将两地剥取后的样品等量分为12份，其中9份用于组学实验，3份用于qRT-PCR验证。另外各取3份长势一致的剑叶和穗用于相关生理指标测定，所有材料液氮冷冻后存储于-80 ℃冰箱。

1.2 仪器设备

安捷伦7890B气相色谱串联5977B质谱仪；固相微萃取装置（Supelco 50/30 μm，DVB/CAR/PDMS，Stableflex (2 cm)）；illumine NovaSeq 6000，illumina公司，美国。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

将剥取的各类籽粒胚乳样品采用LUKYM-1样品冷冻研磨仪（广州）研磨制粉，参数为温度-35 ℃，频率55 Hz，时间50 s，全程保持液氮条件下进行。用于生理指标测定的叶、穗分别设定3个生物学重复。

1.3.2 GC-MS检测

准确称取100 mg粉状样品于20 mL顶空瓶中，加入10 μL 2-辛醇（2-Octanol，纯度≥99.15%）作为内标，90 ℃水浴锅平衡5 min后，迅速插入固相微萃取装置（Supelco 50/30 μm，DVB/CAR/PDMS，Stableflex (2 cm)），60 ℃条件下吸附30 min。

检测平台：Agilent7890B/5977B GC-MS。采用自动进样器进样1 μL样品量。气相条件：气相色谱柱DB-Wax（630 m×250 μm×0.25 μm，美国安捷伦公司）；载气为氦气，流速为1.0 mL/min；不分流进样，程序化升温为40 ℃保持4 min，随后以5 ℃/min的速率上升至245 ℃，保持5 min。质谱条件：电子轰击型离子源；电离电压-70 eV；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；接口温度250 ℃；扫描模式为全扫，质量范围m/z：20～500。

1.3.3 转录组验证测定

用CTAB法提取样本总RNA，完成cDNA文库构建后，使用illumina NovaSeq 6000（illumina公司，美国）高通量测序平台对cDNA文库进行测序，获得原始数据。

采用qRT-PCR技术选取14个差异表达基因进行验证。基因序列信息从The Rice Annotation Project Database（RAP）获得，引物采用Primer 3设计。RNA反转录采用5×ALL-In-One RT MasterMix with AccuRT试剂盒。按照Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（No Rox）试剂盒操作说明对反转录获得的cDNA进行qRT-PCR验证。每个基因采用3个生物学重复和3个技术重复测定表达水平。Actin基因被用作获得Ct值标准化的内源性参照基因，基因的相对表达量采用ΔΔCt法计算。

1.3.4 2 AP合成相关生理指标测定

根据Holmström等[14-16]的方法提取粗酶液用以测定鸟氨酸转氨酶、吡咯啉-5-羧酸合成酶、二胺氧化酶、吡咯啉-5-羧酸盐和丙酮醛，略做修改。称取剑叶和穗的粉样0.300 g左右，加入3 mL Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH值7.5）匀浆，于8 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min，上清液置于-20 ℃条件下储存。

参考Chen等[17-19]等的方法测定鸟氨酸转氨酶活性，酶活性单位为μmol/(g·h·FW)；参考Zhang等[20-22]的方法测定吡咯啉-5-羧酸合成酶活性，酶活性单位为μmol/(g·h)；参考Su等[23-25]的方法测定二胺氧化酶活性，酶活性单位为u/mg protein；参考Wu等[26]的方法测定吡咯啉-5-羧酸含量，单位为μmol/g；丙酮醛含量的测定参考Yadav等[27,28]的方法，单位为μmol/g。

1.4 数据分析

1.4.1 代谢组数据分析

使用Chroma TOF软件（V4.3x，LECO）和NIST数据库对质谱数据进行峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析[29]，根据质谱匹配度、保留时间指数匹配和XIC图特征峰面积等对代谢物进行定性定量鉴定。使用MetaX[29]软件进行无监督主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），采用变量投影重要度（VIP）＞1，差异倍数FC＞1.5或FC＜0.667且Pvalue＜0.05为差异代谢物的筛选条件。

1.4.2 转录组数据分析

使用HISAT2 v2.0.5软件配对末端clean reads与参照基因组比对；采用StringTie（1.3.3b）[30]进行新基因预测；采用featureCounts（1.5.0-p3）计算映射到每个基因的读数；可变剪切分析使用rMATS（4.1.0）软件；使用DESeq2软件（1.20.0）进行龙川组和连山组样本之间的差异表达分析；通过clusterProfiler（3.8.1）软件实现差异表达基因的GO富集分析及分析KEGG通路中差异表达基因的统计富集。

1.4.3 生理指标数据处理

酶活数据采用office2007进行原始数据输入与处理，采用“Statixtix 8.1”（数据分析统计软件，Tallahassee，FL，USA）进行数据处理，其中标准误样本数为3个重复。数据图各处理平均值后无标记表示P≥0.05，无显著差异，标记“*”表示P≤0.05，差异显著（LSD），P≤0.01标记用“**”表示差异极显著（LSD）采用Office 2007进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 “19香”香气物质成分分析

龙川组和连山组样本中的挥发性代谢物成分见表1，两个产地的“19香”共鉴定出220种挥发性代谢物，其中共检测出39种香气物质，分别有10种醛类、8种醇类、8种酮类、5种酸类、3种酚类、3种杂环类以及2种酯类物质。

为更好表达异地种植后“19香”的挥发性代谢物差异性，本实验进行了有监督的PLS-DA分析（图1）。结果表明，两组样本差异显著，另外模型中的R2Y（0.98）和Q2Y（0.90）接近1，且R2Y＞Q2Y，说明模型建立良好。

图1 龙川组和连山组比较对的PLS-DA模型得分散点图Fig.1 The scatter plot of the PLS-DA model for the comparison of the Longchuan formation and the Lianshan formation

2.2 差异香气物质筛选和通路富集分析

进一步基于PLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度（Variable Importance in the Projection，VIP）值和差异倍数（Fold Change，FC），并结合T-test的P值筛选差异表达代谢物，设置条件为VIP＞1.0，差异倍数FC＞1.5或FC＜0.667且Pvalue＜0.05。两组样本中共筛选到14种香气物质的相对含量存在显著差异（表2）。与连山组样本相比，龙川组样本中的2-乙酰基-1-吡咯啉（2AP）和一种表现为泥土味的2-乙基-1-己醇相对含量显著增加，另外12种香气物质相对含量显著减少，主要是酮类、醛类、醇类和酸类物质，这些物质大部分呈现花香、果香等风味。

表2 差异香气物质Table 2 Differential aroma substances

KEGG通路富集分析有助于确定差异代谢物参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。本实验发现的差异代谢物共注释到12条代谢通路（图2），其中显著富集于次级代谢物合成途径。

图2 差异代谢物KEGG代谢通路散点图Fig.2 Scatter plot of differential metabolites KEGG metabolic pathway

2.3 差异表达基因筛选

以|log2(FoldChange)|≥1且pad j≤0.05为筛选条件，从龙川和连山两组样本中共获得145个差异表达基因，其中以连山组样本为对照，龙川组样本有56个基因上调表达，89个基因下调表达，差异结果通过火山图表示（图3）。结果表明同一香稻品种在不同地区种植后在转录水平上存在明显差异。

图3 差异表达基因筛选结果Fig.3 Differentially expressed genes screening results

2.4 功能注释、通路富集和香气物质形成相关基因筛选

采用GO功能和KEGG数据库对差异表达基因进行功能注释和通路富集分析。结果表明，GO功能注释结果表明145个差异表达基因主要参与74个生物过程，涉及到16类细胞组分，在53种分子功能上发挥作用。将生物过程、细胞组分和分子功能前十个条目及注释到对应条目上的基因数量绘制成柱状图进行展示（图4），如图4a结果显示，与连山组相比，龙川组样本中参与生物进程的大部分基因表达量显著下调，但在有机酸分解代谢、多糖分解代谢、光合作用和大分子分解代谢4个生物进程有四个基因的表达量呈上调表达。与所涉及的细胞组分上两组样本表达情况较为相似（图4b），但在分子功能上有所区别（图4c）。以连山组样本为对照，龙川组样本在提高β-淀粉酶活性、水解酶活性、水解O-糖基化合物、氧化还原酶活性以及双加氧酶活性的相关基因表达量显著上调。

图4 差异表达基因在GO功能类别中的分布情况Fig.4 Distribution of differentially expressed genes in GO functional categories

基于转录组的KEGG数据发现145个差异表达基因共注释到20条通路上（图5），其中类胡萝卜素生物合成（dosa00906）为显著富集通路，注释到该途径有三个差异表达基因，两个上调表达基因OsNCED4（Os07g0154100）和OsNCED5（Os12g0617400），一个下调表达基因Os04g0578400，三个基因都是控制脱落酸（ABA）合成关键基因[31]。在本实验中还发现另外三个与脱落酸代谢以及茉莉酸含量调控相关的基因OsFbx352（Os10g0127900）、OsPGIP4（Os05g0104700）和一个MYB转录因子（Os01g0975300）。

图5 差异表达基因KEGG通路分析Fig.5 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes

进一步筛选出最有可能参与香气物质形成的14个差异表达基因，利用qRT-PCR技术进行表达水平验证，其中基因表达量上调有10个，下调表达4个。结果表明，14个差异基因的表达量变化趋势与转录组测序结果变化趋势保持一致（图6）。

图6 转录组验证结果Fig.6 Transcriptome validation results

香稻香气品质对环境极为敏感，有研究发现香稻巴斯马蒂品种在印度和巴基斯坦的Punjab地区种植时，相较于其他地区或国家，香气质量更高[32]。同时有研究表明生态环境中的光、温、水、土壤性质以及非生物胁迫均能影响稻米最终的香气物质[33,34]。其中温度、土壤性质以及非生物胁迫的影响较大。本研究根据KEGG富集分析同样发现差异代谢物富集到次级代谢物的生物合成途径。而次生代谢物的生物合成途径与环境中的气候、土壤条件等因素密切相关[35]。Yu等[36]研究表明香稻品种间差异香气物质与次生代谢物的生物合成、蛋白质消化及吸收有关。本研究中通过对两组样本的qRT-PCR验证发现有两个上调基因在两组样本中具有显著差异。其中Os01g0975300是一个MYB转录因子，通过调节胁迫诱导脱落酸合成，对水稻耐盐和耐旱具有重要作用[37]，还有Os03g0745000是一个热激转录因子，是热胁迫防御响应中的一个调节因子[38]。脱落酸作为一种胁迫激素，因此推测在连山种植“19香”可能遇到了较强的逆境胁迫。广东省的龙川市和连山市均属于亚热带季风气候，根据广东省气象数据显示在六七月份的日平均气温一般达到29～30 ℃，以上两个基因的上调表达，说明“19香”在连山种植时候受到的温度胁迫程度较高，进而引起两地香气物质相对含量上的差异。

脱落酸在籽粒发育过程中具有关键性的作用。Kong等[39]研究在香稻幼苗时期加入外源脱落酸后，采用GC-O和SPME-GC-MS技术发现籽粒中的壬醛气味活性值降低，作者推测脱落酸可能会影响到籽粒中香气物质的改变。同年作者[40]在研究茉莉酸含量与香气物质之间的相关性实验发现，脱落酸和茉莉酸的信号通路之间不同的调节作用有可能会影响香味物质壬醛的代谢途径。结合本研究的RNA-seq数据表明，注释到类胡萝卜素合成途径的三个差异表达基因，Os07g0154100、Os12g0617400和Os04g0578400都是控制脱落酸（ABA）合成相关基因[41]。还发现另外三个与脱落酸代谢以及茉莉酸含量调控相关的基因OsFbx352（Os10g0127900）、OsPGIP4（Os05g0104700）和一个MYB转录因子（Os01g0975300），以上基因在龙川组与连山组比较对中，除了Os04g0578400外，其余基因在龙川组样本中表达量显著上调，结合代谢组学结果中壬醛相对含量在两组样本中的变化，推测脱落酸合成代谢相关基因及茉莉酸含量调控相关基因的表达可能与香气物质壬醛的形成有一定的调控作用，在本实验中表现为负相关。具体的调控机制有待进一步探索。

脂肪酸的合成代谢中的相关基因对C5醛和C9醛物质，如庚醛、戊醛、壬醛和(E)-2-壬烯醛等的合成有一定的调控作用[6]。醇类中的1-辛醇和1-辛烯-3-醇、呋喃类的2-戊基呋喃等是由脂质氧化途径所产生的香气物质。本研究筛选出的差异表达基因里，根据KEGG数据库发现，与脂肪酸合成代谢相关的基因Os04g0445700（编码3-氧代酰基合酶基因）是乙酰辅酶A合成脂肪酸途径的调控基因之一，进一步分析可知，以连山为对照，该基因在龙川样本中的表达量下调，说明在连山样本中合成的脂肪酸含量较高，在相关酶作用下发生的脂质氧化程度也较高，进而在代谢组中表现为具有较高含量的醛醇类等香气物质。

2.5 2AP合成相关生理指标测定

香稻品种中的特征性香气成分2AP的合成途径目前已得到较为清晰地研究。脯氨酸代谢是2AP合成相关的重要途径之一，在相关酶作用下脯氨酸代谢产物Δ1-吡咯啉（2AP的前体物质），能够与糖酵解途径产物甲基乙二醛发生化学反应产生2AP[42,43]，另外鸟氨酸和谷氨酸是2AP合成的重要氮源[9]。

比较两组样本的转录组结果得出，氨基酸代谢途径及多胺降解途径相关基因在两组样本间未达到显著差异，但与2AP前体物质的合成途径的一些关键酶活性具有差异性（图7）。如图所示，与连山相比，龙川组样本显著提高了乳熟期叶片二胺转氨酶（DAO）活性，显著提高了165.38%，而对甲基乙二醛（MG）、鸟氨酸转氨酶（OAT）活性以及吡咯啉-5-羧酸盐（P5C）分别显著降低了24.57%、10%和22.29%。对该时期的叶片而言，与连山相比，龙川样本的吡咯啉-5-羧酸合成酶活性（P5CS）差异不显著。而在籽粒中，与连山相比，龙川样本中的P5C含量、OAT和DAO活性分别显著降低了10.75%、12.33%和641.18%，对P5CS活性和MG含量则显著提高了70.79%和16.40%。结果表明，与连山组样本相比，P5C含量、OAT活性以及DAO活性在龙川组样本中显著降低，而MG含量和P5CS活性则显著提高，说明不同地区种植引起2AP前提物质的合成相关酶活性的差异，其次糖酵解途径产物MG可能是引起最终2AP含量差异的关键物质。另外我们还发现这些酶活性和产物含量在叶片和籽粒中具有不同的表现，说明2AP的生物合成潜在机制较为复杂。目前关于水稻2AP合成的潜在机制的两种说法，有一种说法表明是叶片和茎鞘合成2AP转运到籽粒中，另外一种说法则表示叶片中的脯氨酸转移到籽粒中进行2AP的合成[44,45]，但尚未有研究证明关键性调控机制，还需进一步的研究及验证。

图7 乳熟期2AP在叶片和籽粒中的相关生理指标Fig.7 Physiological indicators of 2AP in leaves and grains at milk maturity

3 结论

本研究着眼于同一香稻品种“19香”通过异地种植所引起的香气品质差异现象以及为扩大香稻种植区域的需求，紧密围绕香稻香气对环境敏感的问题，开展香稻乳熟期籽粒胚乳中香气物质合成相关调控机制的研究。在结合GC-MS非靶向代谢组学和转录组学研究下发现，“19香”在经过两地种植后其香气物质的相对含量发生显著差异，温度胁迫和脂肪酸代谢可能是引起香气物质含量差异的关键因子，脱落酸合成代谢相关基因对香气物质可能具有一定的调控作用，此外在本研究中发现，异地种植同一香稻品种，能量代谢和碳水化合物代谢途径是香气物质2AP合成的关键调控机制。基于对香稻香气物质形成机制的初探，旨在通过代谢组和转录组多组学分析方法，挖掘在大田环境下稻米香气物质形成过程中可能的关键物质与通路，为完善稻米香气形成的网络调控以及日后香稻品种改良提供理论依据。