壮腰通络方对椎间盘退变大鼠髓核细胞焦亡的影响

冯蓬 ，朱立国 ，高春雨 ，张威 ，高景华 ，孙凯 ，李路广 ，车颖 ，回瑾

1.中国中医科学院望京医院，北京 100020； 2.山东中医药大学，山东 济南 250355

椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）是导致盘源性腰痛和其他脊柱退行性疾病的主要原因[1]，是大部分脊柱退行性疾病的重要病理基础，往往在MRI影像中被早期识别[2]。国外研究表明，腰痛的终生患病率高达84%，慢性腰痛的患病率约为23%，有11%～12%患者因腰痛致残[3]。随着人们生活方式的改变，腰痛患病率逐年增加且有年轻化趋势，与IDD的病理改变高度相关[4]。

细胞焦亡是细胞程序性死亡的一种方式。越来越多的研究表明，IDD与髓核细胞（NPCs）焦亡相关，肿瘤坏死因子（TNF）-α及其进一步激活的核因子（NF）-κB信号通路可能是NPCs焦亡的中心环节[5]。在退变的NPCs中，TNF-α、NOD样受体蛋白3（NLRP3）、胱天蛋白酶（Caspase）-1、白细胞介素（IL）-1β表达显著上调，其水平能够反映NPCs的焦亡程度[6]。焦亡的髓核组织进一步释放炎性介质，诱导炎性细胞浸润，引发炎症级联反应[7]。抑制NLRP3激活可以减少细胞外基质降解，对NPCs起到保护作用，从而缓解IDD。

壮腰通络方是朱立国教授在《外台秘要》腰痛类方的证治特点及用药规律基础上总结而成[8]，具有补益肝肾、活血通络作用，用于治疗脊柱退行性疾病所致腰痛及腰椎功能障碍，临床应用多年，疗效显著[9]。实验研究发现，该方能降低腰椎间盘退行性病变大鼠血清炎症因子水平，增加椎间盘组织NPCs数量[10]。本研究观察壮腰通络方对IDD大鼠NPCs焦亡的影响，进一步探究其延缓IDD的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

8周龄SPF级雄性SD大鼠48只，体质量（200±20）g，购于中国食品药品检定研究院，动物生产许可证号SCXK（京）2017-0005。饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所动物房，通风良好，温度20～25 ℃，湿度40%～50%，12 h/12 h光暗交替，自由摄食饮水，动物使用许可证号SYXK（京）2021-0017。本实验经北京隆安实验动物中心伦理委员会审批（BJLongan-L-L-003）。

1.2 药物及制备

壮腰通络方由杜仲、熟地黄、当归、丹参、延胡索、独活、川芎、秦艽、牛膝按15∶15∶12∶12∶10∶10∶10∶12∶12比例组成，饮片购于中国中医科学院望京医院中药房，由中国中医科学院望京医院骨伤科研究所制成原药材浓度分别为25.2、12.6、6.3 g/mL浓缩液备用。TNF-α竞争性抑制剂依那西普，美国MedChemExpress，纯度≥98.0%，货号HY-108847，使用前用生理盐水配制成1 g/mL溶液。

1.3 主要试剂与仪器

BCA蛋白定量检测试剂盒、RIPA裂解液、Cocktail蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF、蛋白上样缓冲液、抗体稀释液、ECL试剂盒（武汉Servicebio，货号分别为G2026-200T、G2002-30ML、G2006-250UL、G2007-1ML、G2008-1ML、G2013-1ML、G2025-100ML、G2014-50ML），中性甲醛（上海碧云天生物技术有限公司，货号P0099），10%EDTA脱钙液（武汉Servicebio，货号G1105），TNF-α、IL-18 ELISA试剂盒（英国Abcam，货号分别为ab236712、ab213909），IL-1β ELISA试剂盒（美国Invitrogen，货号ER5RBX5），Ⅱ型胶原（collagenⅡ）抗体（英国Abcam，货号ab307674），聚集蛋白聚糖（aggrecan）抗体（美国Proteintech，货号13880-1-AP），NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白（IκB）-α抗体（武汉Servicebio，货号分别为GB114320、GB11383、GB11997、GB11212）。垂直电泳仪（武汉Servicebio，型号BV-2），病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号RM2016），显微镜（日本尼康仪器有限公司，型号E100），核磁共振成像系统（德国Siemens，型号MAGNETOM skyra3.0T）。

2 实验方法

2.1 分组及造模

48只大鼠适应性饲养1周后，随机分为正常组、模型组、依那西普组和壮腰通络方高、中、低剂量组，每组8只。除正常组外，其余各组采用针刺尾椎法建立IDD模型[11-12]：戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，选定C6-7、C7-8为针刺间隙，消毒皮肤，以26G针头经纤维环水平穿至髓核中，穿入后将针体旋转360°，保持30 s后垂直拔出，无菌棉球按压针孔15 s。分别于第0、14、28日穿刺。

2.2 给药方法和模型评定

于首次造模后次日开始给药，壮腰通络方高、中、低剂量组分别予252、126、63 g/kg壮腰通络方药液灌胃（相当于60 kg成人临床用药量的2、1、0.5倍），灌胃体积10 mL/kg，每日1次，连续30 d。正常组、模型组和依那西普组灌胃等体积生理盐水。依那西普组造模同时于针刺处注射1 mg/mL依那西普溶液，注射体积10 mL/kg，模型组和壮腰通络方高、中、低剂量组注射等体积生理盐水。给药结束后，利用核磁共振成像系统扫描C6-7、C7-8椎间盘和C8-9椎间盘（正常对照），以评估IDD程度。

2.3 取材

给药结束后麻醉大鼠，腹主动脉取血，3 000 r/min离心15 min，吸取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。用镊子和手术刀剔除附着在C6-7椎间盘周围的软组织，使其可清晰分辨椎体和纤维环包裹的椎间盘，使用手术刀尖端轻轻嵌入上软骨终板与椎体界限，并将上软骨终板翘起，可见透明胶冻状髓核组织，无菌小刮匙取出髓核组织，置于离心管中，液氮暂存，用于Western blot检测。在C8-9离断尾椎，将包含的C7-8椎间盘置于4%多聚甲醛中，随后ETDA脱钙处理，制作石蜡切片（4 μm），用于免疫组化染色。

2.4 指标检测

2.4.1 ELISA检测

取大鼠血清，按ELISA试剂盒说明书操作步骤检测TNF-α、IL-1β、IL-18含量。

2.4.2 Western blot检测

将C6-7髓核组织取出，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂混合液50 μL，冰上裂解15 min，4 ℃、2 000×g离心5 min，收集上清液，进行BCA蛋白定量，加入蛋白上样缓冲液，95 ℃使蛋白变性。每孔上样20 μg蛋白，恒压250 V电泳22 min，恒流300 mA转膜45 min。加aggrecan、collagenⅡ一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加二抗，室温孵育1 h，ECL发光液显影，以GAPDH为内参，Image J 1.5.0软件分析蛋白相对灰度值。

2.4.3 免疫组化染色

C7-8椎间盘石蜡切片脱蜡至水，进行热抗原修复，自然冷却，切片置于PBS（pH7.4）中脱色，3%过氧化氢室温避光孵育25 min，PBS洗涤3次，每次5 min，滴加3%BSA，室温封闭30 min。甩掉封闭液，滴加NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、IκB-α一抗（均为1∶1 000），湿盒内4 ℃孵育过夜。PBS洗涤3次，每次5 min，滴加二抗（1∶200），室温孵育50 min。DAB显色，苏木素复染，400倍视野下观察结果。采用Image J 1.5.0软件对切片进行分析，以平均光密度评价表达强度。

3 统计学方法

4 结果

4.1 各组大鼠椎间盘退变程度评估

正常组大鼠C6-7和C7-8椎间盘信号均一，未见退变征象；模型组、依那西普组和壮腰通络方高、中、低剂量组与正常对照比较，C6-7和C7-8椎间盘信号明显变黑，提示C6-7和C7-8发生IDD。见图1。

图1 各组大鼠椎间盘核磁共振T2加权像

4.2 壮腰通络方对模型大鼠血清肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-18含量的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18含量均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，依那西普组和壮腰通络方高、中剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01），壮腰通络方低剂量组TNF-α含量显著降低（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18含量比较（，pg/mL）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常组模型组依那西普组壮腰通络方高剂量组壮腰通络方中剂量组壮腰通络方低剂量组IL-18 37.30±1.22 56.90±2.66**48.28±1.35##51.63±0.54#51.55±0.47#59.22±2.87只数8 8 8 8 8 8 TNF-α 3.00±0.78 37.85±8.26**0.82±0.64##10.75±0.62##12.20±1.53##24.40±3.35##IL-1β 37.50±0.08 102.50±2.69**50.80±7.63##71.80±7.02##73.20±7.98##100.59±5.15

4.3 壮腰通络方对模型大鼠髓核组织聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠髓核组织aggrean、collagenⅡ蛋白表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，依那西普组和壮腰通络方高、中剂量组aggrean、collagenⅡ蛋白表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。见图2、表2。

表2 各组大鼠髓核组织aggrean、collagenⅡ蛋白表达比较（）

表2 各组大鼠髓核组织aggrean、collagenⅡ蛋白表达比较（）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

collagenⅡ1.000±0.000 0.197±0.004**1.154±0.007##0.780±0.179##0.600±0.090##0.290±0.107组别正常组模型组依那西普组壮腰通络方高剂量组壮腰通络方中剂量组壮腰通络方低剂量组只数8 8 8 8 8 8 aggrean 1.000±0.000 0.584±0.014**0.991±0.012##0.697±0.033#0.725±0.003##0.544±0.064

图2 各组大鼠髓核组织aggrean、collagenⅡ蛋白免疫印迹

4.4 壮腰通络方对模型大鼠髓核组织NOD样受体蛋白3、胱天蛋白酶-1、核因子-κB p65和核因子-κB抑制蛋白-α表达的影响

NLRP3和Caspase-1主要定位在NPCs细胞质和细胞核，NF-κB p65、IκB-α主要在NPCs细胞质表达。正常组有少量NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65表达，IκB-α表达较高；模型组和壮腰通络方低剂量组髓核组织结构紊乱，可见NPCs焦亡后残留的空泡，壮腰通络方高、中剂量组空泡显著减少，髓核组织结构有所恢复。与正常组比较，模型组大鼠髓核组织NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65蛋白表达显著升高，IκB-α蛋白表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，依那西普组和壮腰通络方高、中剂量组大鼠髓核组织NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65蛋白表达显著降低，IκB-α蛋白表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。见图3～图7。

图4 各组大鼠髓核组织Caspase-1表达（免疫组化染色）

图5 各组大鼠髓核组织NF-κB p65表达（免疫组化染色）

图6 各组大鼠髓核组织IκB-α表达（免疫组化染色）

图7 各组大鼠髓核组织NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、IκB-α蛋白表达比较（）

5 讨论

IDD临床表现以腰痛和腰椎功能障碍为主，可归属中医学“腰痛”“腰腿痛”“痹证”范畴，属慢性筋伤骨病。腰部主要有肝经、肾经和膀胱经贯穿，肝主疏泄，肾主藏精纳气。《素问·痿论篇》言“宗筋主束骨而利机关也”，肝肾亏虚导致腰部筋脉失去濡养，使腰部筋骨松弛难以御邪。风、寒、湿是常见侵袭腰部的外来邪气。肝肾亏虚状态下，风、寒、湿邪气乘虚而入，最易伤及腰部筋脉，使本就缺乏濡养的筋脉更加瘀阻，最终导致腰痛。聚焦于临床最为常见的肝肾亏虚、瘀血阻络证型，壮腰通络方以补益肝肾、活血通络为纲，标本兼治。方中杜仲、熟地黄、当归、牛膝滋补肝肾、补血养血，固护肝肾之本；延胡索、川芎、丹参重在行气、活血、通络；独活、秦艽祛风除湿、和血舒筋，祛除筋脉中瘀阻的风、寒、湿邪。

NPCs焦亡是炎症小体激活引发的细胞程序性死亡，与NF-κB信号通路密切相关，是IDD的主要表型改变[13-14]。当IDD发生时，髓核失去内环境稳态，TNF-α激活NPCs的NF-κB信号通路，NF-κB p65合成增加，同时IκB-α泛素化降解程序激活，促进NF-κB p65作为转录因子参与焦亡蛋白合成，最终增加NLRP3炎性小体合成及IL-1β和IL-18前体合成[15-18]。NLRP3炎性小体通过多种途径诱导细胞焦亡，其中诱导Caspase-1前体的自剪切并成熟是最经典的细胞焦亡途径[15]。成熟的Caspase-1进一步剪切Gasdermin D、IL-1β和IL-18前体蛋白使其活化，活化的Gasdermin D释放N端结构域，该结构域结合膜脂并打开细胞膜，导致细胞渗透压变化，成熟的IL-1β和IL-18释放到细胞外，引发炎症瀑布，形成NPCs焦亡恶性循环[15，17]。因此，抑制NPCs焦亡可能是抑制髓核炎症瀑布，阻断NPCs焦亡恶性循环，进而延缓IDD的有效措施[19]。本研究从NPCs焦亡角度探索壮腰通络方治疗IDD的作用机制：首先，ELISA结果表明，壮腰通络方能降低IDD大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-18含量，表明壮腰通络方能够显著降低髓核炎症水平，推测其参与了焦亡关键蛋白IL-1β和IL-18合成及分泌；其次，Western blot结果表明，壮腰通络方能上调髓核组织aggrean、collagenⅡ蛋白表达，二者具有保持髓核水分、维持正常代谢、平衡椎间盘应力的作用，有助于维持髓核的基本生物学功能和抑制内环境诱导的细胞焦亡；最后，免疫组化染色结果显示，壮腰通络方能抑制髓核组织NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65蛋白表达，促进IκB-α蛋白表达，表明壮腰通络方通过抑制NPCs的NF-κB信号通路激活抑制NLRP3炎性小体合成和Caspase-1成熟。

综上所述，壮腰通络方能够显著抑制NPCs焦亡，延缓IDD，其机制可能与抑制髓核组织NF-κB信号通路，限制NLRP3炎性小体和Caspase-1活化有关。本研究进一步明确了壮腰通络方治疗IDD的作用机制，但其具体机制仍有很大探索空间。前期研究发现，髓核是免疫豁免器官，诱导NPCs焦亡的TNF-α并非NPCs本身分泌，而是以M1型巨噬细胞为主导的免疫细胞合成并分泌[18]，M1型巨噬细胞既是退变髓核的主要炎性细胞类型，也是NPCs焦亡恶性循环的始动因素。因此，壮腰通络方是否能对M1型巨噬细胞产生调控作用以限制NPCs焦亡恶性循环，是课题组今后研究的方向。