基于猪体外仿生消化技术研究聚乙二醇对高单宁高粱养分降解效率的影响

李旺,顾晓明,安冬,朱伟云,潘龙

(南京农业大学动物消化道营养国际联合研究中心/江苏省消化道营养与动物健康重点实验室/动物科技学院消化道微生物研究室,江苏 南京 210095)

玉米是我国饲料工业的主要能量饲料原料。随着畜牧业的高速发展,我国玉米资源需求陡然增加,但玉米产量的增幅较小,导致玉米供不应求。此外,在中美贸易摩擦、非洲猪瘟流行和新冠病毒疫情等因素的影响下,玉米价格也急剧攀升,进一步导致我国畜牧养殖业生产成本增高。因此,可替代的能量饲料原料的开发与应用迫在眉睫。

高粱(SorghumbicolorL.)是我国五大谷物之一,种植历史悠久,种质资源丰富。高粱因具有类似玉米的营养价值和种植优势而逐渐受到关注。目前,国内种植的高粱主要用于酿造工业,通常高粱含有较高的单宁含量,这降低了单胃动物尤其是猪对高粱的蛋白质和淀粉等养分利用效率,从而限制了国产高单宁高粱这一非常规饲料原料在饲料工业中的应用。因此,如何高效利用高粱养分成为研究的焦点之一。

聚乙二醇(PEG)是一种非离子型水溶性高分子聚合物,因其具有良好的生物相容性、无毒副作用且价格低廉等优势而被广泛应用在医药、食品以及饲料等多个行业中。聚乙二醇因含有大量的氧原子,能够与单宁中的羟基以氢键形式结合,形成稳定的聚乙二醇-单宁复合物,因此常常被用来屏蔽饲料中单宁的抗营养特性。由于聚乙二醇是一种惰性、不可吸收的分子,聚乙二醇-单宁复合物在pH值2.0～8.5都很稳定,并且在沸水、中酸性洗涤剂和其他有机溶剂中都不溶解[1],聚乙二醇-单宁复合物在动物肠道环境中不易被降解,会被排除体外。在富含单宁的饲料中添加聚乙二醇可以有效阻止单宁的抗营养特性,提高饲料的营养价值[2-3],尤其应用于采食富含单宁草料的反刍动物饲料中[4]。Jones[1]和Waghorn[2]在综述中相继描述了聚乙二醇屏蔽单宁抗营养作用的特性和应用,目前在猪、禽、鼠和羊等多种动物饲料中均有其研究及应用的报道。此外,聚乙二醇缓解单宁抗营养特性的体外和体内的试验效果均很明显[5-6]。因此,综合安全性、稳定性以及屏蔽单宁的效果,聚乙二醇具有提高高单宁高粱养分利用效率的巨大潜力。

本试验主要通过体外仿生消化方法,模拟高粱原料在猪前肠道中化学酶消化作用和后肠道中微生物发酵过程,在高单宁高梁(单宁含量为50 mg·g-1儿茶素当量)原料中添加不同浓度的聚乙二醇探究其对高粱养分降解效率的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料国产高单宁高粱,单宁含量50 mg·g-1(以儿茶素计),总能17.30 MJ·kg-1,粗蛋白含量8.41%,淀粉含量60.04%,粗脂肪含量1.73%,中性洗涤纤维含量12.42%,酸性洗涤纤维含量4.21%,粗灰分1.42%,总磷0.12%,钙0.07%,以上均以风干物质为基础,以质量分数表示。原料经粉碎后过孔径 380 μm 筛后备用。

1.1.2 试剂聚乙二醇(相对分子质量6 000,PEG-6000)购自上海瑞永生物科技有限公司;胃蛋白酶(来源于猪胃黏膜,USP级,1∶30 000)、氯霉素(纯度98%)、香兰素和(+)/-儿茶素(AR级,99.5%)购自上海源叶生物科技有限公司;胰酶(来源于猪胰腺,USP级)购自上海晶纯生化科技股份有限公司。

1.2 试验设计

采用单因素随机试验设计,在高单宁高梁原料中分别添加0、25、50、100和250 mg·g-1的聚乙二醇(PEG添加量/高粱单宁含量比值分别为0、0.5、1、2和5)为处理,每个处理设置5个重复。

1.3 高粱样品的体外酶解

称取4 g粉碎过筛后的国产高单宁高粱样品于500 mL三角瓶中,加入280 mL胃缓冲液(pH2.0)、2 mL 的氯霉素(5 g·L-1,以防酶解过程中出现细菌污染)和8 mL 20 g·L-1的胃蛋白酶,然后置于39 ℃的摇床中以50 r·min-1转速在体外条件下消化4 h。经过4 h体外模拟胃蛋白酶酶解反应后加入100 mL小肠缓冲液(pH7.15),再调整三角瓶内溶液pH值为6.0～7.0,然后加入8 mL胰液素(400 g·L-1),酶解 16 h,用尼龙布过滤后收集残渣,制样,分别测定风干物质、能量和氮素的消失率。养分消失率=(原料养分-酶解后残渣养分)/原料养分×100%。

1.4 高粱样品酶解残渣的体外发酵

1.4.1 培养基配制量取910 mL蒸馏水于细颈瓶中,依次加入0.6 g氯化钾、0.6 g氯化钠、0.2 g氯化钙、0.5 g硫酸镁、1.46 g磷酸二氢钾、3.55 g磷酸氢二钠,再加入微量元素、氯化血红素和脂肪酸溶液各10 mL以及1 mL刃天青和50 mL碳酸氢盐溶液。放入微波炉中加热至沸腾,通二氧化碳至常温(形成无氧环境),配成微生物培养液。分装前加入1 g半胱氨酸盐酸盐,并用0.2 mol·L-1盐酸或0.2 mol·L-1氢氧化钠将pH调至6.8左右。

1.4.2 菌群接种液制备称取100 g来自2头育肥猪(约120 kg)的盲肠-结肠混合食糜于灭菌锥形瓶中,与 1 L灭菌的PBS充分混合,用4层灭菌纱布过滤。在接种物的制备过程中,用二氧化碳气体充气保持厌氧状态。

1.4.3 体外发酵过程准确称取0.5 g胃蛋白酶-胰液素酶解残渣置于250 mL发酵瓶中,每个发酵瓶中添加微生物培养液85 mL,加入1 mL还原剂和1 mL维生素磷酸盐溶液,通入二氧化碳后迅速用橡胶塞封闭,再迅速揭开橡胶塞,依次在每个发酵瓶中加入菌群接种液10 mL,继续通入二氧化碳数秒,然后迅速将发酵瓶用橡胶塞塞紧并用铝盖密封,放入已经预热至39 ℃的摇床中进行体外发酵。同时取3个发酵瓶,只加入微生物培养液,作为空白对照,用于后期数据校正。发酵48 h后用冰袋终止发酵,用尼龙布过滤收集残渣,用去离子水洗涤残渣。将残渣放入65 ℃烘箱中烘干、回潮、称重后用于样品分析。

1.5 缩合单宁的检测

在50 mL离心管中加入1 g高粱原料样品和10 mL甲醇,在室温(25 ℃)下,在磁吸搅拌器上以 450 r·min-1搅拌离心管24 h(避光),然后在4 ℃、3 000 r·min-1离心10 min。离心后的液体在4 ℃保存[7]。将200 μL酸化香兰素试剂加入50 μL的甲醇提取液中,置于96孔板,使用酶标仪测定吸光值(A492),以相同条件处理的香兰素试剂样品作为空白对照,以儿茶素标准品制作标准曲线[7]。单宁含量以每克样品中儿茶素当量表示。

1.6 测定方法

干物质量、能量和氮素含量均按照张丽英[8]的方法进行测定;能量采用微机全自动量热仪(SJLRY-502T,河南鹤壁三杰仪器仪表有限公司)测定;氮素含量采用凯氏定氮仪(SKD-1800,上海沛欧分析仪器有限公司)进行测定。

1.7 数据处理与分析

数据经Excel 2019处理后,使用SAS(Version 9.2)软件中GLM模型进行方差分析,用Tukey’s test进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 聚乙二醇添加量对单宁含量的影响

如图1所示:随着聚乙二醇(PEG-6000)添加量的增加,可检测的高粱单宁含量显著降低(P<0.05),但是各聚乙二醇添加组之间差异不显著。

图1 聚乙二醇添加对单宁含量的影响Fig.1 Effect of polyethylene glycol(PEG)on tannin content不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Different lower cases mean significant differences at 0.05 level. The same below.

2.2 在胃蛋白酶作用下聚乙二醇对高粱养分消失率的影响

在胃蛋白酶的作用下(图2),随着聚乙二醇添加量的增加,高粱的干物质、氮素和总能的消失率线性升高(P<0.05)。25 mg·g-1聚乙二醇处理组的高粱干物质和氮素的消失率显著高于对照组(P<0.05),但是显著低于50、100、250 mg·g-1聚乙二醇处理组(P<0.05);50、100、250 mg·g-1聚乙二醇处理组的高粱总能消失率显著高于对照组(P<0.05);除氮素消失率外,50、100和250 mg·g-1的聚乙二醇处理组之间(聚乙二醇添加量/单宁含量比值为1、2和5)的高粱养分消失率无显著差异(P>0.05)。

图2 聚乙二醇对高粱养分的体外胃蛋白酶酶解效率的影响Fig.2 Effects of PEG on pepsin enzymatic hydrolysis efficiency of sorghum nutrients in vitro

2.3 在胃蛋白酶-胰液素作用下聚乙二醇对高粱养分消失率的影响

在胃蛋白酶-胰液素的作用下(图3),随着聚乙二醇添加量的增加,高粱养分中的干物质、氮素和总能的消失率呈线性升高(P<0.05)。25 mg·g-1聚乙二醇处理组的高粱养分消失率显著高于对照组(P<0.05),但显著低于50、100、250 mg·g-1聚乙二醇处理组(P<0.05);50、100、150 mg·g-1聚乙二醇处理组之间的高粱养分消失率无显著差异(P>0.05)。

图3 聚乙二醇对高粱养分的体外胃蛋白酶-胰液素酶解效率的影响Fig.3 Effects of PEG on pepsin-trypsin enzymatic hydrolysis efficiency of sorghum nutrients in vitro

2.4 在胃蛋白酶-胰液素-微生物作用下聚乙二醇对高粱养分消失率的影响

从图4可知:在胃蛋白酶-胰液素-微生物的作用下,随着聚乙二醇添加量的增加,高粱的风干物质、氮素和总能的消失率呈线性升高(P<0.05)。25 mg·g-1聚乙二醇处理组的高粱养分消失率显著高于对照组(P<0.05),但显著低于50、100、250 mg·g-1聚乙二醇处理组(P<0.05);而50、100、150 mg·g-1聚乙二醇处理组之间的高粱养分消失率无显著差异(P>0.05)。

3 讨论

高粱单宁的酚羟基可以与多糖、蛋白质和金属离子等发生络合反应,抑制动物机体对营养物质的消化吸收[9]。聚乙二醇能够通过其含有的大量氧原子与单宁中酚羟基以氢键形式结合,形成稳定的聚乙二醇-单宁复合物,从而竞争性络合高粱单宁,释放与高粱单宁络合的养分。因此,聚乙二醇可以被用作高粱单宁的吸附剂。本试验结果显示,聚乙二醇可以显著提高高单宁高粱养分的体外消失率。由于单胃动物采食富含单宁的饲料相对较少,所以聚乙二醇在单胃动物饲料中应用的报道较少;在类似反刍动物饲料中研究表明,在富含单宁的日粮中添加聚乙二醇可以提高体外产气速率,消除单宁带来的负面影响[10];聚乙二醇可以提高绵羊的刺槐采食量、氮沉积量、微生物氮产量和日增重[11];在富含缩合单宁的牧草中添加聚乙二醇显著提高了绵羊采食量、饲料养分消化率、料重比、氮保留率和平均日增重[12]。此外,聚乙二醇作为单宁的吸附剂可以显著提高绵羊对饲料养分的消化[13]。上述研究均表明,在动物日粮中添加聚乙二醇可以消除单宁的负面影响并提高养分的消失率,本试验结果与之相符。

饲料养分在动物胃肠中的降解率是衡量饲料营养价值的重要指标。肖敏敏等[14]研究发现,聚乙二醇可以缓解高粱单宁提取物的负面影响,并提高氮素消失率;李大彪等[15]研究也发现,聚乙二醇可以提高富含单宁柠条的体外发酵的产气量和微生物蛋白量。本试验通过体外模拟胃和小肠酶的消化,聚乙二醇提高了高单宁高粱养分的消失率,推测可能因为聚乙二醇与单宁络合形成难溶解的聚乙二醇-单宁复合物,由于聚乙二醇是一种惰性分子,在酸碱环境下不易降解,从而消除了单宁的负面影响。此外,Nsahlai等[6]研究指出,高粱单宁可以降低消化酶的活性,而聚乙二醇可以提高体外酶的活性。因此,聚乙二醇提高高粱养分消失率的原因可能是聚乙二醇不仅可以与单宁络合成不溶的聚乙二醇-单宁复合物,释放高粱养分,还可以缓解高粱单宁对消化酶活性的负面影响,提高消化酶与养分的接触机会。

本试验结果还显示,当聚乙二醇添加量达到与高粱中单宁含量等比例后,再提高聚乙二醇添加量对高粱养分的降解率并没有显著影响。Salem等[11]试验发现,放牧绵羊采食含有单宁的蓝叶相思,补充含有6%、12%、18%和24%聚乙二醇的精料后,其生长性能呈线性增长,且当聚乙二醇添加比例为18%时,氮排泄和生长性能达到最佳水平,但当聚乙二醇添加过量反而导致绵羊氮的沉积量和排泄量增加。李大彪等[15]通过体外试验研究发现,聚乙二醇/柠条单宁含量比例为4∶1时,柠条体外干物质24 h降解率最高。Silanikove等[16-17]报道,山羊(聚乙二醇/单宁含量比为1∶4～1∶8)和绵羊(聚乙二醇/单宁含量比为1∶2)饲料中添加聚乙二醇可完全中和缩合单宁对动物采食量的负面影响;Tiemann等[18]报道,在热带灌木豆类(单宁含量50 g·kg-1)中添加与单宁含量等比例的聚乙二醇,即可消除缩合单宁对瘤胃发酵的负面影响,且对瘤胃发酵没有副作用,本试验结果与之一致。本研究发现,当聚乙二醇添加量和单宁含量比例≥1∶1时均可以显著提高养分的消失率,综合经济成本考虑,建议以聚乙二醇添加量与高粱单宁含量等比例为佳。

综上所述,基于体外仿生消化技术模拟猪的化学酶和微生物降解2种消化方式,25、50、100和250 mg·g-1的聚乙二醇可以提高高单宁高粱(单宁含量为50 mg·g-1)养分的体外消失率,建议在高单宁高粱中聚乙二醇添加量应与高粱中单宁含量等比例为宜。