温度、盐度及pH值对卤虫主要消化酶活力的影响

丁红霞,景素琴,范佩丽,许 涛,刘少贞,宋 晶*

(1. 南风化工集团股份有限公司 技术中心,山西 运城 044000;2. 山西农业大学 动物科学学院,山西 太谷 030801)

消化酶活力是反映动物消化生理机能的一项重要指标,其活力高低决定动物对营养物质消化吸收的能力,决定着动物生长发育的速度。水产动物的消化酶活力研究已有几十年历史,其会受温度、pH值[1]、盐度[2]、光照[3]、金属离子[4]等环境因子的影响,也会随着生长期[5]、昼夜节律[6]、家系[7]、饵料[8]、饥饿状况[9-10]而变化,目前国内外对多种经济甲壳类的主要消化酶活性及各种影响因子进行了详细的研究[11],关于不同型消化酶的提取和酶动力学等方面的研究也越来越受到重视[12]。

卤虫(Artemiasalina)隶属于甲壳纲(Crustacea),鳃足亚纲(Branchiopoda),无甲目(Anostraca),是一种重要的天然饵料,广泛应用于水产育种、观赏鱼饲料加工、保健品等行业。其营养价值丰富,干卵和成虫蛋白质含量都超过50%,并富含多种氨基酸、维生素、矿质元素、不饱和脂肪酸。随着水产养殖规模的扩大,苗种行业的不断发展,仅仅依靠从自然界捕捞卤虫和虫卵,远远不能满足市场需求,因此,国内外很多机构都致力于实现卤虫的全人工养殖[13]。要开发适合于卤虫的饵料,就先要了解其消化酶种类和动力学特征。水产动物生境和食性各异,消化酶的种类和活力可能有很大差异,卤虫是混盐水体中最有代表性的生物饵料,目前尚无此类研究。研究对卤虫的各种消化酶均进行了测定,也对各种消化酶的特性进行了探索,旨在为卤虫的消化生理研究和集约化养殖饲料的研发提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集和预处理

实验所用卤虫成体来自南风化工集团的卤虫养殖基地,于2018-07～08采捕。卤虫样品经过停食和换水,保证消化道内无食物。卤虫成体个体微小,难于解剖提取消化道和消化腺,故进行全虫测定。将所取样品加10倍数体积预冷重蒸水,在玻璃匀浆器中匀浆,充分研碎后用冷冻离心机(TGL-16GR,上海安亭)以4 000 r/min,离心5 min,取上清液备用以测定消化酶活力。

1.2 消化酶的测定方法

采用福林—酚法测定胃蛋白酶和类胰蛋白酶活力,胃蛋白酶反应体系为柠檬酸缓冲液(pH值=3.0),类胰蛋白酶反应体系为硼砂-NaOH缓冲液(pH值=9.8)。采用淀粉—碘比色法测定淀粉酶活力,采用比色法测定脂肪酶活力(A054-1,南京建成)。采用3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活力。酶液蛋白浓度用考马斯亮蓝法测定(A045-2,南京建成)。所有酶活指标测定都采用3个重复,以比活力(全活力与蛋白含量的比值)进行比较。

1.3 不同盐度、温度、pH值下卤虫各消化酶的测定

对生活于不同盐度高盐水体中的卤虫,进行消化酶活力测定,池水的盐度分别为14.0%、16.0%和19.4%。盐度先用比重计粗测,采水回实验室后又以光学盐度计校准,盐度变化范围不超过0.2%。

所测温度范围为15～60 ℃,组距为5 ℃。高于室温的温度在恒温水浴锅中获得,低于室温的温度以水为介质在低温循环槽(DC-5006,上海慈弦)中获得,各组温差均可控制在0.5 ℃以内。

所测定的pH值范围为2.0～12.0,组距为1,依赖5组不同的缓冲对实现[14],各组pH值的变化范围不超过0.1。具体缓冲对的选用见表1。

表1 不同pH的缓冲系表Tab.1 The list of buffer system to different pH ranges

1.4 数据处理

所有数据采用Excel软件处理并制图, SPSS18.0软件进行单因素方差分析(ANOVA),以新复极差法(Duncan’s test)检验不同盐度、温度、pH值下消化酶比活力差异,显著水平为0.05。

2 研究结果

2.1 不同盐度下卤虫的各种消化酶活力

结果表明,卤虫体内具有多种消化酶,包括胃蛋白酶、类胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶。除了纤维素酶,其余四种消化酶都表现出较高的活力,尤其是类胰蛋白酶。随着盐度的升高,各种消化酶的活力出现了不同程度的下降,但大多差异不显著,只有盐度19.4%时,脂肪酶活力显著低于盐度14.0%和16.0%(见图1)。

图1 不同盐度下卤虫的各种消化酶活力Fig.1 The digestive enzyme activities in A. salina at different salinities注:P表示胃蛋白酶(Pepsin);T表示类胰蛋白酶(Tryptase);A表示淀粉酶(Amylase);L表示脂肪酶(Lipase);C表示纤维素酶(Cellulase)。上方的小写字母表示消化酶活力在不同盐度下的显著性,字母相同为处于同一显著水平。

2.2 不同温度下卤虫的各种消化酶的活力

结果表明,温度对卤虫消化酶活力有较大影响,不同种类的酶比活力差异较大(见图2)。类胰蛋白酶在40～60 ℃活力较高,在50 ℃附近达到峰值,胃蛋白酶在35～50 ℃活力较高,在45 ℃附近达到峰值;卤虫以类胰蛋白酶为主消化蛋白质。淀粉酶和脂肪酶在温度较低时也有明显活力,其最适作用温度分别是25 ℃和30 ℃,在50 ℃和45 ℃难以检出活力。纤维素酶的比活力不高,在30～60 ℃方能检出活力,45～55 ℃活力较高。

图2 不同温度下卤虫的各种消化酶活力Fig.2 The digestive enzyme activities in A. salina at different temperatures注:P表示胃蛋白酶(Pepsin);T表示类胰蛋白酶(Tryptase);A表示淀粉酶(Amylase);L表示脂肪酶(Lipase);C表示纤维素酶(Cellulase)。

图3 不同pH值下卤虫的各种消化酶活力Fig.3 The digestive enzyme activities in A.salina at different pH values

2.3 不同pH值下卤虫的各消化酶的活力

结果表明,卤虫的消化酶只会作用于特定的pH值区间。胃蛋白酶是酸性蛋白酶,只在pH值2.0～6.0检出活力,3.0是其活力峰值,酶活力向两侧递减,pH值2.0～4.0区间均有较高活力。类胰蛋白酶作用的pH值范围较大,7.0～9.0是其活力最强的作用区间。淀粉酶和脂肪酶在中性条件下活力最高,酶活力向两侧递减。纤维素酶的比活力不高,仅在pH值4.0～8.0能够检出,pH值5.0附近活力值最大,但与其他pH值差异不显著。

3 讨论

3.1 卤虫体内消化酶的种类

水产动物体内消化酶的种类和其食性密切相关,多种水产动物在特定发育阶段,尤其是食性变化期,消化酶活力会随之变动。草食性甲壳动物幼体为适应低能量的饵料,通常维持较高消化酶活性,加快食物转化,但其同化作用较低;肉食性甲壳动物幼体消化酶活性通常较低;通过延长高能食物的滞留时间,以最大限度地提高甲壳动物的同化效率[15]。

卤虫(A.salina)是典型的被动滤食生物,只能滤食50 μm以下的颗粒,对大小5～16 μm的颗粒有较高的摄食率,在天然环境中主要以细菌、微藻和有机碎屑等为食,其食物随地域、季节等变化,具有很大的随机性。因其个体微小,难于对消化道和消化腺体进行分离,故以整体匀浆的方法进行测定,结果表明,卤虫体内具有多种消化酶,包括胃蛋白酶、类胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶。5种主要消化酶,都表现出一定的活力,这同对虾蟹类的消化酶种类的研究结果相似。和其他的甲壳动物一样,类胰蛋白酶是最主要的消化酶[16-17]。

整体取样测定发现纤维素酶活力较低,卤虫可能仅具微弱的消化酶活力,也不排除酶活力来自消化道微生物的可能。纤维素酶其实不是一种单一的消化酶,而是一类能够降解β-1,4-葡萄糖苷键酶的总称,包括各有作用的C1酶、Cx酶和β-葡萄糖苷酶。对于甲壳类体内是否含有纤维素酶,不同研究者的测定结果各异,这可能与测定方法和底物的选择有关[18]。虽然大多甲壳类水产动物没有表现出较高的纤维素酶活力,但对在饲料中添加纤维素酶可促进畜产和鱼类生长已得到证实,纤维素酶能够将纤维素分解为葡萄糖参与代谢,也有助于破坏植物源饲料的胞壁结构[19]。

3.2 盐度对卤虫体内各种消化酶活力的影响

一些水生生物对盐度有较强的适应能力,这种适应又可以分为主动调节型和被动适应型,卤虫就属于后者[20]。伴随着化工生产和自然季候变化,盐湖中的盐度并不稳定,卤虫能较好地适应混盐水体中的多种盐度。之前关于盐度对水生生物消化酶活力影响的研究,主要集中于洄游种类、河口种类、潮间带—滩涂种类和盐碱性水体种类。

在实验室进行此类研究,一般需要对实验动物进行驯化,但是暂养水平的参差不齐、动物的适应性较差、驯化时间难以确定等因素会大大影响实验结果,目前对哈氏仿对虾(Parapenaeopsishardwickii)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、日本蟳(Charybdisjaponica)等虾蟹类[21-23]和以单环刺螠[24]为代表的螠形动物的相关研究表明,动物在等渗环境中,渗透调节代谢耗能最少,用于生长及其他生理过程的能量转换效率最高;在非等渗环境中,要消耗体内储存的能量,来适应水体的盐度变化。盐水中的丰富离子也会成为动物消化酶活力的激活剂或者抑制剂。盐度对消化酶活力的影响是一个复杂的综合作用。实验中,并未对卤虫进行长期的盐度驯化,直接选取了自然条件下盐度较为稳定的3种盐度水体(14.0%、16.0%、19.4%)中的卤虫进行酶活力测定。结果表明,随着盐度的升高,各种消化酶的活力出现了下降,但大多差异不显著,只有盐度19.4%时,脂肪酶活力显著低于盐度14.0%和16.0%。

3.3 温度对卤虫体内各种消化酶活力的影响

最适温度的测定是在实验规定的反应时间条件下进行的,实际上生物体内酶起作用的时间会长得多,所以最适温度只在特定条件下才有意义,但也在一定程度上反映消化酶的耐热性,通过由此计算而来的活化能的大小可用来比较不同种酶活力的大小。消化酶是酶的一种,酶促反应是温度的函数。温度对消化酶活力的影响主要表现在两个方面,一方面随着温度的升高,酶催化反应速度加快,致使单位时间内酶活力升高;另一方面当温度低于或超过临界值时,又会引起消化酶变性和失活,从而导致酶活力降低。实验表明,温度对卤虫消化酶活力有较大影响,不同种类的酶比活力差异较大。类胰蛋白酶在40～60 ℃活力较高,在50 ℃附近达到峰值,胃蛋白酶在35～50 ℃活力较高,在45 ℃附近达到峰值;卤虫以类胰蛋白酶为主消化蛋白质。淀粉酶和脂肪酶在温度较低时也有明显的活力,其最适作用温度分别是25 ℃和30 ℃,在50 ℃和45 ℃难以检出活力。纤维素酶作用范围窄且比活力不高,在30～60 ℃方能检出活力,45～55 ℃活力较高。卤虫的多种消化酶都具有一定的热稳定性,其一般与酶作用温度的范围正相关,其热稳定性依次为类胰蛋白酶>胃蛋白酶>淀粉酶≈脂肪酶>纤维素酶。

3.4 pH值对卤虫体内各种消化酶活力的影响

在酶促反应过程中,当介质缓冲溶液pH值改变时,反应速度会有一个最大值,称最适pH值。其受多种因素的影响,不同的缓冲体系、金属离子的参与、各种抑制剂的存在都会影响到最适pH值。最适pH值与生物本身消化道pH值常常不一致,甚至有极大的差别,因为消化酶起作用时的最适pH值不仅取决于酶活性中心的性质,且与底物和介质等有关[25]。一般来说, 生物消化道内的pH值条件能够极大地满足其不同种消化酶活力的表现。多数甲壳动物的前肠液呈弱酸性,除了两种蛋白酶,大部分消化酶的最适pH值与消化道内pH值差异不大[20]。实验结果表明,卤虫的消化酶只会作用于特定的pH值区间。胃蛋白酶只在pH值2.0～6.0时检出活力,pH值3.0是其活力峰值,酶活力向两侧递减,pH值在2.0～4.0区间均有较高活力。类胰蛋白酶作用的pH值范围较大,7.0～9.0是其活力最强的作用区间。淀粉酶和脂肪酶在中性条件下活力最高,酶活力向两侧递减。纤维素酶的比活力不高,仅在pH值4.0～8.0能够检出,pH值5.0附近活力值最大,但与其他pH值差异不显著。