高糖饲料对草鱼生长及肝脏糖代谢的影响

陈志钊，朱 涛，雷彩霞，姜 鹏，杜金星，朱俊杰，宋红梅，李胜杰

1.湖州师范学院 生命科学学院，浙江 湖州 313000

2.中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广东 广州 510380

草鱼 (Ctenopharyngodonidella) 是我国重要的大宗淡水经济鱼类，养殖总产量约占我国淡水经济鱼类总产量的1/5[1]。当前，可持续发展是草鱼产业面临的主要挑战之一，而饲料成本控制是其中最主要的一环。糖类是水产饲料中最为廉价的能量来源，在饲料中添加一定量的糖类物质具有蛋白质节约效应和活化氨基酸的作用，能有效节省饲料成本[2]。然而，与哺乳动物不同，鱼类被认为是“天生的糖尿病患者”，对葡萄糖的利用能力较低，饲料中过多的糖类可能导致鱼类出现生长迟缓、肝脏肿大、损伤等问题[3-5]。

草鱼喜好以天然水草为饵料，与其他饵料相比，水草的粗蛋白含量高、粗纤维含量低[6]，富含糖类物质[7]；因此，草鱼是研究鱼类糖利用能力的理想对象。目前认为，在相同蛋白水平下，适宜草鱼生长的饲料糖水平为15%～33%，当饲料糖水平超过40%时，其生长性能受到抑制，肠系膜脂肪沉积增加，糖类无法发挥蛋白质节约作用[8-10]。但也有研究显示，饲喂6%、22%和38% 3 种糖水平饲料的草鱼特定或相对生长率无显著性差异[11]。用25%、45%和50% 3 种糖水平饲料饲喂草鱼的研究也得到了相似结果，且糖水平超过40%时仍能发挥蛋白质节约效应[12]；此外，当糖水平同为42%时，低蛋白质饲料能促进草鱼相对和特定生长率的增加[13]。由此可见，不同高糖饲料下草鱼的生长性能表现不一致，仅从糖水平高低的角度无法完全解释其生长性能差异。

探索糖代谢与生长之间的关系，是交叉融合了水产营养学与育种学的新型研究方向。本实验室前期从糖酵解途径中挖掘到与草鱼生长相关的SNP 位点[14]，且草鱼快长和慢长群体中糖酵解、糖异生和糖原合成途径中的一些关键基因表达量差异显著[15]，推测糖代谢调控可能与草鱼生长密切相关。已有研究发现，摄食高糖饲料后，不同于肉食性鱼类，草鱼肝脏能够调节糖酵解途径的葡萄糖激酶 (Glucokinase,Gk)和糖异生途径的葡萄糖-6-磷酸酶 (Glucose-6-phosphatase,G6pase) 的基因表达以应对摄入的过量糖[9,16]。糖酵解和糖异生途径的糖代谢相关基因表达可能受到鱼体体质量、饲料中主要能量源添加(蛋白质、糖类和脂质)水平以及养殖时间等因素的影响[9-10,13,17]。研究不同营养参数、养殖时间对糖代谢相关基因，暨对糖酵解的关键限速酶Gk 和丙酮酸激酶 (Pyruvate kinase,Pk)、糖异生的关键限速酶G6pase 和磷酸烯醇式丙酮酸碳羧化酶 (Phosphoenolpyruvate carboxykinase,Pepck)、糖原合酶 (Glycogen synthase,Gys) 和脂肪酸合成酶 (Fatty acid synthase,Fas) 基因表达的影响，有助于解释饲喂高糖饲料草鱼出现亚健康状态表征和生长性能下降的原因。

目前对草鱼糖类物质营养需求的研究多局限于体质量约10 g 的草鱼[8-10,12]，尚不清楚体质量约100 g 草鱼的营养需求是否符合已有的研究成果。为探究饲喂高糖饲料不同时间下，体质量约100 g草鱼的生长性能及肝脏糖代谢相关基因的表达变化，本研究配制了普通糖和高糖两种饲料对草鱼进行长期投喂，定期测量其生长指标和与糖代谢相关的生理生化指标，分析肝脏糖代谢相关基因的表达变化规律，综合评价其生长性能和健康水平，为草鱼糖代谢与生长之间的关系提供理论基础，并为耐糖性状选育研究提供依据和方向。

1 材料与方法

1.1 实验饲料与试剂耗材

参照陈团等[18]对饲料糖源的选择，及Cai 等[10]对饲料糖水平的设置，本研究以木薯生淀粉作为鱼体可消化糖源，以细统糠 (主要成分为纤维素) 作为不可消化的等碳添加物，分别配制饲料糖质量分数为15% (普通饲料) 和40% (高糖饲料) 的等氮等能饲料。所有原料 (淮安市禾丰饲料有限公司提供) 粉碎过80 目筛后，采用逐级扩大法混匀后，加入大豆油及适量蒸馏水再次混匀，经螺旋挤压机加工成直径4 mm 的硬颗粒饲料，自然风干后于-20 ℃保存待用。饲料配方和营养组成见表1。

表1 实验饲料配方及常规成分分析Table 1 Formulation and proximate composition of diets

实验所用组织固定液购自武汉赛维尔生物科技有限公司，血糖、肝/肌糖原含量检测试剂盒、胰岛素ELISA 检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。RNA 保护液 (RNAsafer Stabilizer Reagent)购自Omega Bio-Tek 公司，总RNA 分离试剂 (Trizol Reagent) 购自Thermo Fisher Scientific 公司，逆转录、荧光定量试剂盒均购自TaKaRa Bio Inc.公司。

1.2 实验设计及饲养管理

实验用草鱼购自广州市南沙海鸥岛养殖场，在广东梁氏水产种业有限公司英德基地开展实验。实验鱼暂养2 周后，选取平均体质量为 (132.01±16.43) g 的草鱼1 800 尾，随机分成两组，每组设3 个重复，每个重复300 尾鱼，放入长10 m×宽10 m 室外水泥池中养殖。两组分别投喂普通饲料(对照组) 和高糖饲料 (高糖组)，每日8:00 和16:00 投喂2 次，每次投喂至鱼群不再进食为止。养殖期间，水泥池不间断充氧，每天吸污排污，隔3 d 换水1 次，换水量约为池水的1/3，水体pH维持在7.7～7.9，养殖时间为140 d。在第40 、第60 、第80 和第140 天时，从每个池中随机挑选已禁食24 h 的20 尾草鱼测量体质量、体长和体高；挑选10 尾从尾静脉采集血液置于抗凝管中，制备血浆用于检测血糖和胰岛素含量，另取肝脏组织称质量，置于RNA 保存液中4 ℃过夜，再转至-80 ℃冰箱保存。第140 天时，每个重复挑选10 尾草鱼测量内脏团、肠系膜脂肪质量，采集部分肝脏和肌肉组织快速置于液氮下保存，再用于检测糖原，另采集部分肝脏和肠道组织置于多聚甲醛溶液中固定，用于制备组织切片。所有样品的保存方式均为单一个体单管保存。

1.3 指标测定

1.3.1 生长性能测定

测量不同时期两组草鱼的体质量增长率(Weight gain rate,RWGR)、肥满度 (Fullness,RF)、脏体比 (Viserosomatic index,RVI)、肝体比 (Hepatosomatic index,RHI)、肠系膜脂肪系数 (Mesenteric fat index,RMFI)和空壳质量 (Eviscerated mass,WE)，计算公式如下：

式中：W0为实验草鱼的初始体质量；W1为实验草鱼的终末体质量；L1为实验草鱼的终末体长；Wv、Wh、Wm分别为实验草鱼的内脏团总质量、肝脏总质量、肠系膜脂肪总质量。

1.3.2 血糖、胰岛素含量测定

血糖、血浆胰岛素含量检测分别按照葡萄糖含量检测试剂盒、鱼胰岛素测试盒说明书操作，使用多功能酶标仪Cytation 5 (BioTek,America)检测样品吸光度，计算血糖和胰岛素含量。

1.3.3 组织糖原含量测定

采用肝/肌糖原测定试剂盒测定每个个体肝脏和肌肉组织中的糖原含量，按试剂盒说明书操作步骤，将样品漂洗、吸干、研磨后水解制备糖原检测液，用UV-7504 型单光束紫外可见分光光度计 (上海欣茂仪器有限公司) 于波长620 nm、光径1 cm下检测样品的OD 值，计算糖原含量。

1.3.4 组织切片制作与观察

将采集自第140 天的肝脏和中肠样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片机切片、HE 染色，制备的切片在ZEISS Scope.A1 正置显微镜下成像拍照，使用Microsoft PowerPoint 2016 软件整理和标注图片，检查肝脏和肠道组织的健康状况。成像完成后统一以毫米为标准单位，使用Image-Pro Plus 6.0 软件分别测量每张切片中5 根完整肠绒毛高度及对应的5 处绒毛宽度。

1.3.5 肝脏糖代谢相关基因表达分析

取已采集的肝脏组织匀浆后用TRIzol™试剂裂解，通过氯仿-异丙醇分离沉淀总RNA，经75%(体积分数)乙醇洗涤后重新溶解总RNA。使用多功能酶标仪Cytation 5 (BioTek,美国) 检测RNA 浓度及纯度，用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。按照PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time) 说明书反转录合成cDNA，置于-20 ℃保存。以β-actin为内参基因，采用RTPCR 检测肝脏糖代谢相关基因在不同养殖时间下的相对表达量。荧光定量PCR 反应体系为20 μL，包括上下游引物各0.5 μL、模板cDNA 2 μL、去离子水7 μL、TB Green (SYBR 酶)10 μL，引物序列见表2。反应在LightCycler® 96 Instrument 荧光定量PCR 仪上进行，反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35 个循环。每个样品进行3 次重复实验，采用2-ΔΔCT法计算各基因的相对表达量，以40 d 对照组的相对表达量为对照，分析各组各时间下该基因的表达量差异。

表2 草鱼糖代谢相关基因 qRT-PCR 引物Table 2 qRT-PCR primers of grass carp glycometabolism genes

1.3.6 数据处理

使用SPSS Statistics 26 软件对实验数据进行分析，生长指标、糖原含量、肠道组织绒毛高度、宽度和肌层厚度使用独立样本t检验法分析两组样本间的差异；基因的相对表达量数据使用单因素方差分析 (One-way ANOVA)，采用Duncan's 法进行组间多重比较。结果用“平均值±标准差()”表示，差异显著水平为P＜0.05，P＜0.01 时差异极显著。使用Excel 2016、PowerPoint 2016 软件作图。

2 结果

2.1 高糖和低糖饲料对草鱼生长性能的影响

两组草鱼的生长性能各指标如表3 所示，相较于对照组，高糖组草鱼体质量在第60 和第80 天显著提高 (P＜0.05)，并在第140 天时极显著提高(P＜0.01)；体质量增长率在第60 和第80 天时显著提高 (P＜0.05)；体高在第60 和第140 天时极显著提高 (P＜0.01)；肥满度在第40、第80 和第140 天时极显著提高 (P＜0.01)；在第140 天时，草鱼脏体比、肠系膜脂肪系数和空壳质量均极显著提高 (P＜0.01)。而两组草鱼的体长、肝体比无显著性差异 (P＞0.05)。

表3 高糖饲料对草鱼生长性能的影响Table 3 Effects of dietary carbohydrate on growth performance of grass carp

2.2 两种不同糖水平饲料对草鱼血糖、胰岛素、糖原的影响

如表4 所示，高糖组和对照组草鱼在各个时期的空腹血糖均无显著性差异 (P＞0.05)。第140 天时，高糖组草鱼血浆胰岛素、肝糖原和肌糖原质量分数均高于对照组，其中肝糖原质量分数差异性显著 (P＜0.05)。

表4 高糖饲料对草鱼血糖、胰岛素、糖原的影响Table 4 Effects of dietary carbohydrate on plasma glucose,insulin and glycogen of grass carp

2.3 肝脏、肠道组织切片观察

2.3.1 肝脏组织外形、HE 染色切片观察

将经HE 染色的第140 天草鱼肝脏组织切片置于显微镜中观察 (图1)。以中央静脉为中心，对照组肝组织中肝索呈放射状整齐排列，相邻肝索吻合成网状，肝索之间可见肝血窦；细胞大小正常，呈椭圆形，细胞核大、居中，空泡不明显。高糖组肝脏组织的肝索排列规则，肝血窦细长狭窄，肝细胞稍膨大，细胞核不在细胞中央，空泡数量较多。

图1 草鱼肝脏组织结构注：a.对照组草鱼肝脏 (400×)；b.高糖组草鱼肝脏 (400×)；c.对照组草鱼肝脏 (1 000×)；d.高糖组草鱼肝脏 (1 000×)。Fig.1 Tissue slices of liver of grass carpNote: a.Liver of grass carp (400×); b.Liver in Group H of grass carp (400×); c.Liver in control group of grass carp (1 000×); d.Liver in Group H of grass carp (1 000×).

2.3.2 肠道组织结构

将经HE 染色的中肠肠道组织切片置于显微镜中观察 (图2)，对照组绒毛结构完整，上皮细胞排列规整紧密，未见损伤，绒毛近、中端形态正常。但绒毛远端出现肿胀，比例为80% (n=10)。高糖组绒毛结构有不同程度的损伤，绒毛肿胀、变形并伴有绒毛折叠，肠腔面积增大，纹状缘缺刻，比例为90% (n=10)。在400×显微镜下观察 (图2-c—d)，对照组微绒毛排列紧密、均匀，高糖组微绒毛排列疏松，出现膨胀。经测量和分析 (图3，N=50)，高糖组肠绒毛高度极显著高于对照组，但两组间绒毛宽度和肌层厚度差异不显著 (P＞0.05)。

图2 草鱼中肠组织结构注：a.对照组草鱼中肠 (100×)；b.高糖组草鱼中肠 (100×)；c.对照组草鱼中肠 (400×)；d.高糖组草鱼中肠 (400×)。Fig.2 Tissue slices of midgut of grass carpNote: a.Midgut in Control group grass carp (100 ×); b.Midgut in Group H of grass carp (100×);c.Midgut in control group of grass carp (400×); d.Midgut in Group H of grass carp (400×).

图3 高糖饲料对草鱼肠道组织绒毛高度、宽度和肌层厚度的影响Fig.3 Effects of dietary carbohydrate on villus height,villus width and muscle layer thickness

2.4 不同时期草鱼肝脏组织糖代谢相关基因的表达

2.4.1 糖酵解关键基因的表达

如图4-a 所示，随着养殖时间的增加，高糖组的gk基因 mRNA 表达量均呈下降趋势，对照组表达量在所有时间上无显著变化 (P＞0.05)。第40 天时高糖组的gk基因 mRNA 表达量显著高于对照组(P＜0.05)，其余时间两组间无显著性差异。高糖组的pk基因 mRNA 表达量随养殖时间的增加整体呈下降趋势，对照组表达量在所有时间上无显著变化(P＞0.05，图4-b)。第60 和第140 天时，高糖组表达量显著低于对照组 (P＜0.05)，而第40 和第80 天时两组间无显著性差异 (P＞0.05)。

图4 草鱼肝脏糖代谢相关基因的表达注：方柱上的不同大写字母表示同一时间点高糖组、对照组的相对表达量差异显著，不同小写字母表示同一组在不同时间点的相对表达量差异显著 (P＜0.05)。Fig.4 Relative expression of genes related to liver glucose metabolism in grass carpNote: Different uppercase letters on the square columns indicate significant differences in relative expression levels between the high glucose group and the control group at the same time point,while different lowercase letters on the square columns indicate significant differences in relative expression levels of the same group at different time points (P＜0.05).

2.4.2 糖异生关键基因的表达

如图4-c 所示，随着养殖时间的增加，高糖组和对照组的pepck基因 mRNA 表达量均呈上升趋势，第140 天时两组的表达量均达峰值。其中第40 天时高糖组的表达量显著低于对照组，其余时间两组间的表达量无显著性差异。高糖组和对照组的g6pase基因 mRNA 表达量随养殖时间的增加均呈升高趋势 (图4-d)。相较于对照组，第40 和第60 天高糖组的g6pase基因 mRNA 表达量显著降低，第80 和第140 天时显著提高。

2.4.3 糖原、脂肪合成关键基因的表达

如图4-e 所示，高糖组和对照组的gys2基因mRNA 表达量随养殖时间增加均呈下降趋势，但第40 天时高糖组的gys2基因 mRNA 表达量与对照组无显著性差异，第40 和第60 天时高糖组的表达量均显著高于对照组。高糖组和对照组的fas基因mRNA 表达量随养殖时间增加总体呈下降趋势(图4-f)，相较于对照组，高糖组的fas基因 mRNA表达量在第40 天时显著降低，第60 和第140 天时显著提高。

3 讨论

3.1 饲喂高糖饲料对草鱼生长性能的影响

在饲料中添加适宜水平的糖有助于提高鱼类的生长性能。根据已有研究，饲喂糖水平低于38%的饲料，草鱼幼鱼的生长性能无显著变化[8,10]；但当饲料糖水平超过40%时，草鱼的生长性能显著下降[8,10,22]，并引起血糖升高和肝肿大[5,8-9,23]。纤维素是鱼类饲料中常用的填料和黏合剂[24-25]，鱼类对纤维素的利用能力有限[26]，为了研究不同糖水平饲料对赤点石斑鱼(Epinephelusakaara)生长性能的影响[27]，纤维素作为等碳添加物的添加量达1.97%～33.3%，将纤维素作为不可消化的糖源配制等氮等能饲料不会影响草鱼的生长性能[10,26]。本研究中饲喂添加40%木薯淀粉饲料的高糖组草鱼，体质量在第60、第80 和第140 天时显著高于对照组，在第140 天时空壳质量显著高于对照组，说明添加40% 木薯淀粉的高糖饲料可促进草鱼体质量增加，且体质量的增加主要源于肌肉质量增加。摄食高糖饲料提高鱼类生长性能的结果在其他草食性鱼类中也有报道，在脂质水平低的饲料中添加高水平糖能够促进银鲫 (Carassiusgibelio)[24]、团头鲂 (Megalobramaamblycephala)[28]的生长，摄食高糖饲料后生长性能表现不同可能与糖类、脂质和蛋白质三者的交互作用有关。Abimorad 等[29]配制了包含2 种蛋白质水平、2 种脂质水平和3 种糖水平的12 种饲料饲喂草食性鱼类细鳞鲳(Piaractusmesopotamicus)，结果显示20%蛋白质水平的高糖(50%) 饲料可显著降低其体质量增长率，而23%蛋白质水平的高糖饲料可显著提高其体质量增长率，40%和80%脂质水平的高糖饲料对体质量增长率的影响也不相同，相似的结果在短盖巨脂鲤(Piaractusbrachypomus)[30]、黄颡鱼 (Pelteobagrus fulvidraco)[31]中也有报道。在草鱼的研究中，将高糖 (45%) 饲料的蛋白质水平从32%降至20%显著提高了体质量增长率[13]，说明草鱼摄食高糖饲料后出现的生长性能表现差异可能与营养素间的交互作用有关。

长期摄食高水平糖饲料会导致草鱼肝体指数增加[32-33]，引起代谢紊乱[34]，从而抑制其生长。本研究中高糖组草鱼肝脏糖原水平相比对照组显著提高，肝体指数增加但差异不显著，肝细胞形态发生了改变，总体反映出高糖组草鱼肝脏糖代谢负担加重，但并没有因糖原和脂肪积累而发生明显肝肿大，也未对生长性能造成明显的负面影响。尽管高糖组草鱼肝脏gys2和fas基因 mRNA 表达水平在第40 和第60 天均显著高于对照组，但随着养殖时间延长，高糖组草鱼gys2和fas基因 mRNA 表达水平整体呈下降趋势，这与Fang 等[19]用高糖水平饲料饲喂草鱼的结果相似，表明草鱼可能通过自身新陈代谢减少肝糖原和脂肪的积累，从而减轻对肝脏器官损伤。中肠组织切片观测发现，高糖组绒毛形态改变，出现损伤，这可能与实验草鱼处于生长阶段早期、肠道形态结构对鱼体营养状况反应敏感有关[19]。实验组草鱼在第60 和第80 天时体质量增长率显著高于对照组，而在第140 天时高糖组体质量增长率高于对照组但差异不显著，可能受饲喂高糖饲料导致草鱼幼鱼肠道绒毛宽度减少、消化与吸收能力降低的影响[19,35]，从而引起实验组草鱼生长速度减缓。

3.2 高糖饲料对肝脏糖代谢的调节

糖酵解是鱼类葡萄糖分解的唯一途径，其中葡萄糖激酶是肝脏中催化葡萄糖分解的第一个关键酶，饲喂高糖饲料的团头鲂[36]、尼罗罗非鱼 (Oreochromisniloticus)[17]和虹鳟 (Oncorhynchusmykiss)[26,37]等多种鱼类肝脏糖酵解相关基因表达水平显著升高。本研究中，随实验时间延长饲喂高糖饲料组和对照组的草鱼肝脏gk基因表达水平无显著性差异，与Fang 等[19]饲喂草鱼高糖(60%)饲料73 d 未能显著改变肝脏gk基因表达水平的结果一致。但Cai 等[10]用高糖饲料饲喂草鱼56 d 后发现高糖饲料组的gk基因表达水平显著升高，推测可能与饲喂时间长短有关。Boonanuntanasarn 等[17]研究不同糖水平饲料饲喂罗非鱼时发现，短期 (45 d) 饲喂高糖饲料显著提高了gk基因表达水平，而长期 (90 d) 饲喂对gk基因表达水平无显著性影响，该研究结果与本研究一致。本实验饲喂草鱼高糖饲料短期(40 d) 内显著提高了肝脏的gk基因表达水平，而长期 (140 d) 饲喂对gk基因表达水平无显著性影响，表明短期和长期饲喂高糖饲料对草鱼肝脏gk基因表达的影响不同，这可能是分子水平上的一种适应性调节[17]。

糖异生是非糖类物质转化合成葡萄糖的过程，葡萄糖-6-磷酸酶是糖异生途径中直接催化葡萄糖合成的酶，同时在肝糖原合成葡萄糖的反应中也起催化作用。高糖饲料对不同鱼类肝脏g6pase基因表达水平的影响不同，对同一种鱼类也可能存在不同影响。已有研究发现，饲喂高糖饲料不会显著改变银鲫[24]、罗非鱼[17]、虹鳟在空腹时肝脏g6pase基因表达水平；而Song 等[25]和 Marandel 等[16]采用高糖饲料饲喂虹鳟，发现其肝脏g6pase基因表达水平显著升高。在本实验条件下，饲喂高糖饲料140 d 草鱼肝脏g6pase基因表达水平显著升高，与Cai 等[10]、徐晶等[38]的研究结果相似。Qiang等[39]饲喂罗非鱼高糖饲料0、27、45 d，发现其肝脏g6pase基因表达水平随实验时间延长而升高；Boonanuntanasarn 等[17]长期饲喂罗非鱼不同糖水平饲料，90 d 高糖饲料组肝脏g6pase基因表达水平较45 d 高，表明持续饲喂罗非鱼高糖饲料可提高其肝脏g6pase基因表达水平。本研究高糖组g6pase基因表达水平随实验时间的延长而升高，并在第140 天时显著高于对照组，与上述罗非鱼的研究结果相似[17,39]；表明长期饲喂草鱼高糖饲料会导致g6pase基因表达水平升高，推测可能与本研究高糖组胰岛素水平较高和血糖水平较低有关。胰岛素可促进糖酵解、脂肪合成、糖原合成并抑制糖异生来降低血糖水平[40]，当血糖水平较低时，机体通过提高g6pase基因表达水平来转化中间代谢物，重新合成葡萄糖并补充血糖含量。

4 结论

综上，采用高糖 (40%) 饲料投喂草鱼可促进其体质量的增加，但长期饲喂会对其生理指标产生一定的负面影响，肝脏糖代谢相关基因表达变化显著，合成肝糖原和脂肪酸是葡萄糖的主要转化方式。本研究结果可为探明适宜草鱼生长的饲料糖水平提供数据支持，也可为后续耐糖性状标记的开发提供理论依据。