利用实验室病原微生物抽检控制实验动物质量

汪 斌，王 倩

（华中科技大学同济医学院附属同济医院科研处实验动物中心，武汉 430100）

作为建立人类疾病模型筛选评价的重要载体，实验动物是从事科学研究、教学、生产、检定等工作的重要工具，在生命医学科学研究中起重要作用［1-3］。小鼠基因组与人类高度同源，且小鼠生殖能力强、繁育快、饲养成本低，因此是生命科学和医学研究中重要的模式动物［4，5］，但是实验小鼠在生产、使用以及运输过程中存在感染病原体的可能，尤其是某些隐性感染，很有可能存在向环境扩散的危害，造成生物安全问题，甚至引起疾病流行、暴发，危及人类的健康［6-8］。因此，加强对外来购入小鼠的病原微生物检测，无疑是加强生物安全的有力手段［9］。为了确保实验动物生产机构提供合格的实验动物，确保科研工作的顺利进行，防止人畜共患病对动物及饲养、科研人员的健康影响，华中科技大学同济医学院附属同济医院科研处实验动物中心坚持对外购实验动物进行抽检监测。本研究对2022 年抽检的714 只实验小鼠进行了病原菌、寄生虫检测，分析病毒检测结果，为保障科研工作的开展和相关人员的安全提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物来源

2022 年华中科技大学同济医学院附属同济医院科研处实验动物中心共检测境内市售实验动物生产机构的实验小鼠714 只，分别来自7 家不同的生产机构。

1.2 主要试剂

美国Xpress Bio 公司的ELISA 诊断试剂盒，苏州西山生物有限公司的ELISA 诊断试剂盒和小鼠病毒荧光定量PCR 检测试剂盒，梅里埃公司的API 20E型肠杆菌鉴定试剂盒、API STAPH 型葡萄球菌鉴定试剂盒、API 20NE 型非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒，广州迪景公司的哥伦比亚血琼脂，青岛海博生物科技公司的多种细菌鉴别培养基等。

1.3 仪器设备

Bio-Rad CFX96 型实时荧光PCR 仪（Bio-Rad 美国伯乐生命医学产品有限公司）；生物安全柜（海尔生物医疗公司）；酶标仪、自动洗板机（Thermo 赛默飞世尔科技公司）；生物显微镜（LEICA 徕卡仪器有限公司）、电热恒温培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 实验鼠的抽检 对每家机构售卖的不同品系实验鼠进行抽检，每个品系抽取1 只进行采样解剖，隔离检疫7 d后，检测结果均为阴性才判为检测合格。

1.4.2 隔离检疫室的设置 传递仓作为运输通道传递检疫动物及其饲养所需器具和材料。隔离检疫室配有无菌IVC 2 台。

对进入本动物中心的外来小鼠都有隔离检疫期，时长7 d，在此期间对实验鼠进行动物行为学和临床症状观测。若发现小鼠有被毛杂乱无光泽、皮肤溃烂、眼部炎性反应、口鼻黏膜潮红、耳部青紫、四肢运动不协调、肛门红肿溃烂、体型消瘦、精神萎靡、步态失常、躁郁不安等症状，按照GB 14922.2—2011《实验动物微生物学等级及监测》和GB 14922.1—2001《实验动物寄生虫学等级及监测》的要求进行取样检测。

1.4.3 病理剖检 对在隔离检疫过程中随机抽样检测的实验鼠及有临床表现的实验鼠实施剖检，并对其各组织器官的病变情况进行观察。

1.4.4 寄生虫检测 采用透明胶带粘取法粘取小鼠眼周、腹股沟及肛周样本，刀片刮取皮层物取样后显微镜下观察，进行体外节肢寄生虫检测；取血后收集血清，采用ELISA 法对弓形虫进行检测；将回盲内容物或粪便直接涂片，显微镜下观察检测蠕虫、肠道鞭毛虫和纤毛虫。

1.4.5 病原菌检测 将气管内容物接种于血平皿；回盲内容物接种于胆硫乳（DHL）琼脂、高盐甘露醇（SP）琼脂以及NAC 液体培养基。筛选可疑菌后分离纯化，革兰氏染色镜检后，接种到相对应的API 20E 型肠杆菌鉴定试剂盒、API STAPH 型葡萄球菌鉴定试剂盒、API 20NE 型非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒中进行生化反应。使用API 微生物系统检测国家标准要求必检的沙门菌、鼠棒状杆菌、嗜肺巴斯德杆菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌。对于国家标准未明确要求检测的潜在病原菌采取伴随检测和取病灶于哥伦比亚血琼脂涂板，在恒温箱中37 ℃培养24 h 后，挑取可疑菌，采用哥伦比亚血琼脂纯培养后取样的方式进行细菌鉴定。使用Elisa 法对支原体和泰泽病原体进行检测。

1.4.6 病毒检测 小鼠心脏取血后离心收集血清，使用Elisa 法检测鼠痘病毒、小鼠肝炎病毒、小鼠仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、小鼠细小病毒，并使用荧光定量PCR 的方法对可疑样本进行复检。若抽检小鼠为裸鼠或其他免疫缺陷小鼠，则取该小鼠的粪便以及气管、肺、肝脏等组织提取RNA或DNA，使用荧光定量PCR 的方法进行检测。

2 结果与分析

经检疫，7 个不同生产机构的实验小鼠质量不同，有两家公司的合格率为100%，其他公司都有检测出病原体，具体结果如表1 所示。在65 批次的小鼠中，共检出4 种病原菌，其中绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌是国家标准要求为阴性的人兽共患病病原菌（表2）；奇异变形杆菌是对人致病，但未被定为人兽共患病的病原菌［10-12］。木糖葡萄球菌则是在4 家公司多次检测到（表3）。

表1 2022 年购入的实验小鼠检疫情况

表2 65 批次实验小鼠的病原检测结果

表3 国家标准未做要求但对屏障系统具有损害的病原菌检出结果

检出的病原菌大多以条件致病菌为主，其中金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌可导致化脓性感染，其他单位也有检出，应引起生产机构的重视［13，14］。奇异变形杆菌是一种条件致病菌，可引起人和动物感染，主要存在于人与动物的体表黏膜与消化道，产生的相关毒素可引起食物中毒，有些可以和化脓性球菌混合感染，引起继发性感染等，并可引起多种疾病，如尿道炎、肾盂肾炎、中耳炎和菌血症等［15，16］。该菌广泛存在于土壤、水和被粪便污染的物质中，在肠道和医院环境中也大量存在，是重要的医源性感染条件致病菌［17，18］。木糖葡萄球菌一直被认为是非致病菌或条件致病菌，但已有研究者分离出强β-溶血菌株，并结合其生化特性，推测判定该菌是导致病鼠腿部溃烂的致病菌［19，20］。4家公司的4个品系小鼠都检测出该菌，因此木糖葡萄球菌的检测应重点关注。

3 讨论

对市售实验小鼠的病原监测，基本针对在生产单位进行自检或抽检，往往忽略了运输过程等因素对小鼠的应激而诱发疾病。本研究主要通过对来自省内外的7 个实验动物生产机构的实验小鼠病原菌、寄生虫和病毒进行监测，了解不同机构之间实验动物运输等外界条件对实验动物质量的影响，以期为改善和提升实验动物质量方面提供参考。不同机构的实验小鼠品质参差不齐，主要原因可能有以下几种。①实验小鼠生产环节的质量控制存在缺陷。各省区实验动物检验监督机构的抽检、复检频率不同，检测资源、人员等都有所限制，市售实验动物的送检频率、数量不同，导致不同生产机构的实验动物质量不同。因此，加强对生产机构对实验动物的自检管理势在必行。②实验小鼠运输环节的质控存在问题。从本研究统计的数据来看，本中心大部分使用的小鼠都是从外省购入，这就涉及包装、运输等问题，运输是实验动物行业的必要环节，在监测中，春季和秋季的运输出现问题较少，夏季和冬季由于温度问题，开箱时经常发现有小鼠死亡，尤其是裸鼠的死亡情况较为严重。在运输过程中运输盒内小鼠密度、运输时间、禁食禁水、机场等候或车辆运输中的环境温度、包装是否破损、搬运装载等因素若处理不当，均会使实验小鼠产生应激导致其抵抗力下降，直接影响实验小鼠的质量，诱发条件致病菌大量繁殖甚至使小鼠死亡。因此，注意在运输途中的动物福利问题显得尤为重要。③隔离检疫的质控环节存在问题。《实验动物管理条例》中有规定明确指出，对引入的实验动物必须进行隔离检疫。但根据监测管理经验，许多潜在的条件致病菌往往在隔离检疫期过后才能被检测出，3～5 d 的隔离检疫期内携带病原的小鼠也不会发病，导致抽检结果不够准确，因此，延长隔离检疫的时间、增加抽检小鼠的数量也是非常必要的。

虽然对外购小鼠进行抽检能够有效避免其携带的病原微生物进入本中心的动物屏障设施，但也有一些问题亟待解决。①未被列入国家标准但存在致病性的病原体在抽检过程中被检出。如奇异变形杆菌在2022 年的抽检中被检出，该病原菌虽然不在国家标准要求不得检出的病原菌范围内，但这种菌是医源性感染的重要条件致病菌，这种细菌很有可能会影响相关人员的身体健康，对实验的正常进行造成干扰。因此，针对不同的实验操作人员和实验环境，扩大病原体的检测项目非常重要。②细菌的致病性并不是不变的，有些非致病菌也有转变为致病菌的可能，虽然在本中心分离得到的木糖葡萄球菌一般被认为是非致病菌，但也有文献报道这种菌有可能是一种新的致病菌，会导致病鼠的腿部溃烂，所以也应该加强对于非致病菌致病性的跟踪观察。