基于网络药理学和分子对接探讨二氢杨梅素对线粒体自噬的作用机制

张 燕，于官正，张 钰，涂 星，3，黄 琪，边卓阳，陈亚君

（1.长江大学附属荆州医院肿瘤科，湖北 荆州 434023；2.湖北民族大学医学部，湖北 恩施 445000；3.湖北民族大学武陵山中药材检验检测中心，湖北 恩施 445000）

线粒体自噬（mitochondrial autophagy）是一种选择性自噬，通过自噬选择性地去除或降解受损线粒体的过程，其对维持细胞功能具有重要作用[1]。有研究发现[2]，线粒体自噬与肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等多种临床疾病的发病机制有关，通过对线粒体自噬进行干预，可能会具有治疗作用。二氢杨梅素（dihydromyrucetin，DMY）是一种多酚羟基二氢黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、维持血糖稳态、改善认知障碍等药理作用，对神经系统疾病、心血管系统疾病、内分泌系统疾病有治疗或保护作用[3]。研究表明[4，5]，DMY 可通过激活自噬预防糖尿病心肌病、改善肝纤维化等。但DMY 是否可以通过多靶点、多通路调节线粒体自噬尚不清楚。故，本研究通过网络药理学的方法，探讨DMY 对线粒体自噬的作用机制，为其提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 化合物靶点的预测和疾病靶点的筛选 通过PubChem 数据库检索“Dihydromyricetin”的SMILES号，将其输入Swiss Target Prediction 数据库，以“Homo sapiens”为设置条件，进行化合物靶点的预测，删除预测结果中的重复靶点，并以“Probability”值＞0 为筛选条件，筛选后的靶点为最终的靶点。以“mitophagy”为检索词在GeneCards 数据库（https://www.genecards.org）和NCBI 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行疾病靶点的筛选，删除重复值，合并2个疾病数据库的靶点。

1.2 蛋白相互作用（PPI）网络 利用R 4.0.2 软件对得到化合物与疾病靶点取交集得到化合物疾病的共有靶点并绘制韦恩图；将共有靶点输入String 数据库（https://string-db.org/）构建PPI 网络模型，最小相互作用阈值设定“custom value”（＞0.40），得到PPI 网络；并对PPI 网络数据进行网络拓扑学分析。

1.3 GO 功能和KEGG 通路富集分析及构建“化合物-靶点-通路”网络图 运用R 4.1.3 软件及“org.Hs.eg.db”“enrichplot”“ggplot2”等安装包对共有靶点进行GO 功能与KEGG 富集通路分析，设置P＜0.05；并使用在线作图平台微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）对其进行可视化处理。使用Cytoscape3.7.2 软件对共有靶点和KEGG 通路富集的结果进行“化合物-靶点-信号通路”网络图的构建。

1.4 分子对接 将DMY 与15 个作用靶点进行分子对接验证，通过PubChem 数据库、Chem Bio3D Ultra 14.0 软件获得DMY 的3D 结构；利用PDB 数据库下载15 个靶点蛋白，利用PyMOL 2.4.0 软件和Auto Dock Tools 1.5.6、Autodock Vina 软件对作用靶点和DMY 进行常规处理及分子对接。

2 结果

2.1 化合物预测和疾病靶点的筛选的结果 在Swiss Target Prediction 数据库靶点预测得到化合物100 个靶点，经筛选后最终得到70 个靶点。GeneCards 数据库1903 个靶点，NCBI 数据库569 个靶点，最终疾病靶点为2248 个靶点。

2.2 PPI 网络结果 化合物靶点与疾病的靶点取交集后得到15 个共有靶点，通过在String 数据库构建的PPI 网络结果显示，共有15 个节点，32 条边，其中每个节点表示蛋白，每条边表示不同蛋白之间的相互作用，见图1。根据网络拓扑学分析Degree值排名的结果可知HIF1A、KDR、APP 等排名较前，见表1。

表1 PPI 网络靶点的拓扑分析

图1 化合物疾病交集图与PPI 网络图

2.3 GO 功能和KEGG 通路富集分析及“化合物-靶点-通路”网络图 GO 功能富集分析主要包括生物过程、细胞组成和分子功能。在生物过程方面，共富集916 个结果，主要包括对氧化应激的反应、金属离子的反应等；在细胞组成方面，共富集39 个结果，主要为膜筏、核点、胶质细胞反应等；在分子功能方面，共富集72 个结果，主要为蛋白磷酸酶结合、跨膜受体蛋白络氨酸激酶活性等；排名前15 的GO 功能结果见图2。KEGG 富集通路共富集40 条通路结果，主要为癌症蛋白聚糖、癌症、MAPK 等信号通路，排名前10 的KEGG 富集通路结果见图3。通过“化合物-靶点-通路”网络图可知，不同靶点与通路之间有着相互作用，图中各连线表示靶点与通路直接的联系，靶点越大表示其富集的通路越多，DMY 与线粒体自噬存在多靶点、多通路的相互作用关系，见图4。

图2 GO 功能富集分析

图4 “化合物-靶点-通路”网络图

2.4 分子对接结果 将DMY 与15 个作用靶点进行分子对接验证，结果表明DMY 均能与15 个靶点结合，其中与FGFR1 结合效果最佳，与PPARG 的结合效果次之，见表2、图5。

表2 DMY 与15 个作用靶点对接结合能（kcal/mol）

图5 分子对接图

3 讨论

本研究PPI 网络的拓扑分析结果显示，HIF1A、KDR、APP 等靶点关联度较高。有研究发现[6，7]，DMY可介导HIF1A 的表达降低，而HIF1A 是HIF-1 的活性亚基，HIF-1 可以通过多种方面控制线粒体的活性，是缺氧诱导的线粒体自噬的中枢调剂。KDR也称血管内皮生长因子受体-2（VEGFA-2），属于血管内皮生长因子受体（VEGFA）的一种，DMY 在影响胃癌细胞VEGFA 表达的同时可抑制KDR 在血管内皮细胞中的表达[8，9]。此外，KDR 与可溶性蛋白聚糖相互作用，引起乳腺癌细胞线粒体自噬[10]。APP与Tau 对线粒体自噬具有协同作用，而DMY 可影响APP/PS1 转基因小鼠的学习记忆力[11，12]。由此可知，HIF1A、KDR、APP 等靶点与DMY 和线粒体自噬密切相关。

本研究中GO 功能富集和KEGG 富集通路结果显示，DMY 与线粒体自噬的生物过程主要富集于对氧化应激、金属离子等的反应，分子功能主要富集为蛋白磷酸酶结合、跨膜受体蛋白络氨酸激酶活性等；DMY 与线粒体自噬富集于癌症蛋白聚糖、癌症、MAPK 等40 条信号通路上。有研究发现[13，14]，氧化应激与线粒体自噬具有相互作用，氧化应激受损可加强线粒体的自噬程度，而线粒体自噬在一定程度上能调节抗氧化的水平，而DMY 可通过调节细胞凋亡的线粒体而保护内皮细胞，使其不受氧化应激。另有研究表明[15，16]，脑出血时，周围组织的氧化应激和离子紊乱会影响活性氧含量、线粒体膜电位，从而导致线粒体外膜去极化，引起PINK1/Parkin 通路诱导的线粒体自噬；而DMY 可以与铜、锌等多种金属离子发生反应，增强DMY 抑菌杀菌、抗氧化的作用。另外，MAPKA/AERK/CREB 信号通路可调节MFN2 相关的线粒体自噬[17]；MAPK 通路中的JNK信号通路参与调控多种细胞活动，其中JNK 蛋白激酶中的JNK2 可诱导线粒体自噬，保护组织器官的损伤[18]；p38MAPK/STAT3 信号通路可通过抑制线粒体自噬改善胰岛素分泌[19，20]。

综上所述，通过网络药理学和分子对接技术对DMY 与线粒体自噬的机制进行探讨，预测得到DMY 可能通过作用于HIF1A、KDR、APP 等多个靶点，调控癌症蛋白聚糖、癌症、MAPK 等多信号通路，改善对氧化应激、金属离子等的反应，从而参与线粒体自噬。