降浊合剂通过调节TLR4/IκBα/NF-κB信号通路影响肥胖大鼠糖脂代谢

苏 琼，江丹娜，钟 钊，周 开，龚文波

1.浙江中医药大学附属宁波中医院内分泌科，浙江 宁波 315010

2.浙江中医药大学附属宁波中医院心内科，浙江 宁波 315010

3.浙江中医药大学附属宁波中医院风湿科，浙江 宁波 315010

肥胖是指体内脂肪堆积过剩造成体重过度增长，可能导致胰岛素抵抗、糖尿病、心血管疾病和某些癌症的发生，是影响健康的第五大危险因素［1-3］。目前，肥胖症的治疗及相关并发症的预防缺乏有效的方法，迫切需要开发新的、更安全、更有效的治疗肥胖的药物。

随着中医药研究的不断深入，中药制剂在改善肥胖、调节肝脏脂肪代谢方面的优势日益突出。如在自发型肥胖型糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝病中，中药材辣木叶醇的提取物可通过调节生化指标改善大鼠肥胖和肝脏质量［4］；中药汤剂温胆汤可改善胰岛素抵抗肥胖大鼠的糖脂代谢并抑制炎症因子水平，还可通过调节关键转录因子改善肥胖大鼠的临床症状［5-6］。降浊合剂是由浙江中医药大学附属宁波市中医院主任中医师王晖根据多年临床用药经验创立的中药复方，具有补气升清降浊的作用，可有效改善患者的糖脂代谢及肠道菌群紊乱状态，在治疗气虚痰浊型糖耐量异常疾病和气虚痰浊型2型糖尿病中具有较好的疗效［7-9］。此外，降浊合剂还可影响谷氨酸钠肥胖大鼠糖脂代谢，降低谷氨酸钠肥胖大鼠的胆固醇、游离脂肪酸、血胰岛素水平［10］。肥胖可以导致胰岛素抵抗，而胰岛素抵抗与糖脂代谢关系密切。研究发现，电针通过抑制TLR4/IκBα/NF-κB通路可以改善肥胖胰岛素抵抗大鼠的胰岛素敏感性［11］。为此，在前期研究基础上，本研究进一步探究降浊合剂对肥胖大鼠糖脂代谢的影响，以及这种影响与TLR4/IκBα/NF-κB 通路的相关性，以期探索降浊合剂治疗肥胖症的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物、试剂及仪器

30 只清洁级雄性SD 大鼠，体重（120±10）g，由浙江省实验动物中心提供［生产许可证号:SYXK（浙）2016-0022］，饲养于浙江省中医药研究院实验动物中心，温度（22±2）℃，湿度50%～60%，12 h昼夜节律饲养，实验动物使用许可证号:SYXK（浙）2019-0010。普通饲料为实验动物标准饲料，由浙江省中医药研究院实验动物中心提供。动物实验研究方案通过浙江百越生物技术有限公司伦理委员会审查（ZJBYLA-IACUC-20200302）。

降浊合剂组方含生黄芪30 g、丹参30 g、生苍术15 g、生薏苡仁30 g、生麦芽30 g、生扁豆30 g、绞股蓝30 g、生鸡内金15 g、生葛根30 g、生山楂30 g、荷叶15 g，浓缩至生药浓度5 g/mL，由浙江中医药大学附属宁波市中医院提供。

TRIzol（批号119704）为美国Ambion 公司产品；异丙醇（批号2015122801）为成都市科龙化工试剂厂产品；三氯甲烷（批号20180109）为杭州高晶精细化工有限公司产品；无水乙醇（批号2018051801）为成都市科隆化学品有限公司产品；逆转录试剂盒（批号AK22355A）、荧光定量PCR 试剂盒（批号AK31128A）为日本TaKaRa 公司产品；PRDM16、UCP1 引物为生工生物工程（上海）股份有限公司产品；PRDM16 兔多克隆抗体（批号16k7094）为美国Affinity 公司产品；GAPDH兔多克隆抗体（批号P1020）为杭州戴格生物技术有限公司产品；UCP1 抗体兔多克隆抗体（批号00084987）为美国Proteintech 公司产品；全蛋白提取试剂盒（批号KGP2100）为江苏凯基生物技术股份有限公司产品；BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号080719191118）、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（批号P0012A）和TBST（批号ST673）为上海碧云天生物技术有限公司产品；全自动蛋白定量分析试剂盒（12-230ku）（批号34360）为美国Protein Simple 公司产品。

离心机（Centrifuge 5810R）为德国Eppendorf公司产品；全自动生化分析仪（AU5831）为美国Beckman 公司产品；StepOnePlus 实时荧光定量PCR 仪为美国Applied Biosystems 公司产品；正置荧光显微镜（ECLIPSE 80i）为日本Nikon 公司产品；WES 全自动蛋白定量分析仪为美国Protein Simple公司产品；组织脱水机（TP1020-1）、石蜡包埋机（EG1150）、石蜡切片机（RM2235）为德国Leica 公司产品；增强化学发光试剂（4AW011-200）为北京四正柏生物科技有限公司产品；偏氟乙烯膜（IPSN07852）为美国Millipore公司产品。

1.2 肥胖大鼠模型的建立及分组处理

30 只大鼠被随机分为正常对照组、模型对照组和降浊合剂组，每组各10只。其中正常对照组大鼠给予足量普通饲料10 mL/kg 灌胃，自由饮食饮水，共8周；模型对照组大鼠给予足量高脂饲料（食用化猪油15.0%、蔗糖20.0%、胆固醇1.2%、胆盐0.2%、普通饲料63.6%）10 mL/kg 灌胃，自由饮食饮水，共8周；降浊合剂组大鼠给予足量高脂饲料（同模型对照组）10 mL/kg 加降浊合剂浓缩液50 g/kg灌胃［10］，自由饮食饮水，共8周。然后禁食24 h进行后续实验。

1.3 生化分析仪检测血糖、血脂指标水平

采用3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）对空腹大鼠进行腹腔注射麻醉，随后主动脉取血5 mL，3220×g离心后采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血糖、总胆固醇、三酰甘油、LDL-C和HDL-C水平。

1.4 计算脂肪质量系数、Lee’s指数

采用3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）对空腹大鼠进行腹腔注射麻醉后，后颈椎脱位处死大鼠，使用小剪刀纵切皮肤暴露腹股沟脂肪，剥离淋巴结，剪下白色脂肪，然后剪开肩胛骨下皮肤看到呈对称的棕色脂肪，去除表面的白色脂肪后剪下棕色脂肪。分别称取腹部白色脂肪、肩胛部棕色脂肪组织，计算脂肪质量系数:脂肪质量系数=脂肪质量/体重×100%。根据大鼠体长，计算Lee’s 指数:。完成后，切取不同部位脂肪约1/4置于10% 中性福尔马林溶液中保存备用。另取不同部位脂肪，液氮速冻后保存于-80 ℃中，用于基因和蛋白表达检测。

1.5 定量逆转录PCR 法检测脂肪中PRDM16、UCP1的mRNA表达

取上述冻存的白色、棕色脂肪组织80～100 mg，液氮研磨后采用TRIzol 法提取总RNA，按照试剂盒说明进行定量逆转录PCR 检测。逆转录反应条件:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。定量PCR 反应条件:95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃30 s，40 个循环；熔解曲线95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。PRDM16上游引物5'-CAAGGACTGC GAGCGGATGTTC-3'，下游引物5'-TCTGGTGGCG GATGAGGTTGG-3'；UCP1上游引物5'-CAGAGG TGGTGAAGGTCAGAATGC-3'，下游引物5'-GAG TCGTCCCTTTCCACAGTGTTG-3'；内参基因EF-1α上游引物5'-CGAGCCACCATACAGTCAGA-3'，下游引物5'-CCATTCCAACCAGAAATTGG-3'。采用2-ΔΔCt法进行分析。

1.6 蛋白质印迹法检测脂肪中PRDM16、TLR4、磷酸化IκBα和NF-κB的蛋白表达

取上述各组大鼠白色、棕色脂肪组织，液氮研磨，用全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，按照全自动蛋白定量分析试剂盒的操作说明检测PRDM16 蛋白表达，在反应板内依次加入蛋白样品3 µL/孔，抗体稀释液10 µL/孔，兔抗鼠PRDM16抗体（一抗，1∶20稀释）10 µL/孔，兔抗鼠GAPDH 抗体（内参，1∶100 稀释），兔抗鼠β-肌动蛋白抗体（内参，1∶100 稀释）10 µL/孔，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G 抗体（二抗）10 µL/孔，发光液15 µL/孔，清洗缓冲液500 µL/孔，采用全自动蛋白定量分析仪检测并采用Compass 软件分析峰面积，蛋白相对表达水平用目标蛋白峰面积/内参蛋白峰面积比值表示。TLR4、磷酸化IκBα 和NF-κB 的蛋白表达检测具体步骤如下:使用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质（20 µg），并转移到聚偏氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉进行封闭。分别加入TLR4 抗体（一抗，1∶1000 稀释）、磷酸化IκBα 抗体（一抗，1∶1000稀释）、NF-κB-p65抗体（一抗，1∶1000 稀释）和β-肌动蛋白抗体（内参，1∶1000 稀释）在4 ℃下孵育过夜反应，用0.1 mol/L TBST 冲洗三次。再用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G抗体（二抗）在室温下孵育2 h。最后，使用增强化学发光试剂检测特异性蛋白信号。使用Image J 软件对特定蛋白信号的灰度值进行检测和归一化。

1.7 免疫组织化学法检测脂肪组织中UCP1 的蛋白表达

将脂肪组织在10%中性福尔马林溶液中浸泡3～4 h，固定后分别采用75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯溶液进行脱水，常规浸蜡包埋，按照所需切面用单面刀片将蜡块切成梯状，并用蜡铲将蜡块底部固定于载蜡器，采用旋转切片机进行4 µm 连续切片，二甲苯脱蜡，滴加3%的过氧化氢后室温封闭静置10 min，滴加酸碱度为6.0 的0.01 mol/L 枸橼酸盐缓冲液冲洗，将石蜡切片置于烤箱中微波修复20 min，5% 牛 血 清 白 蛋 白 封 闭1 h，UCP1 一抗（1∶50 稀释）于4 ℃冰箱孵育，二抗室温孵育30 min，常规二氨基联苯胺显色、苏木素复染、脱水、封片，采用NIS-Elements D 3.2 图像分析系统，放大200倍镜下随机选取5个视野，通过分析染色强度（棕褐色）来确定阳性区域，计算阳性染色部位的面积占总视野面积的百分比，判定UCP1的表达情况。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0 软件进行统计分析。正态分布的计量数据用均数±标准差（±s）描述，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著差数法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 降浊合剂对肥胖鼠血糖和血脂指标的影响

与正常对照组比较，模型对照组三酰甘油水平升高（P＜0.05）；与模型对照组比较，降浊合剂组三酰甘油水平降低（P＜0.05），见表1。结果提示，降浊合剂可以改善肥胖鼠高脂饮食导致的血脂异常。

表1 三组血糖和血脂指标比较Table 1 Blood glucose and blood lipid indexes in the three groups of rats（± s，mmol/L）

表1 三组血糖和血脂指标比较Table 1 Blood glucose and blood lipid indexes in the three groups of rats（± s，mmol/L）

与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，#P＜0.05.LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇.

HDL-C 0.90±0.16 0.80±0.19 0.81±0.18组 别正常对照组模型对照组降浊合剂组n 10 10 10血 糖6.18±0.79 6.78±0.49 6.17±1.07总胆固醇1.41±0.26 1.61±0.33 1.37±0.36三酰甘油0.75±0.22 1.11±0.31*0.73±0.27#LDL-C 0.55±0.06 0.59±0.09 0.57±0.07

2.2 降浊合剂对肥胖鼠脂肪质量的影响

8 周后，与正常对照组比较，模型对照组的白色脂肪质量和白色脂肪系数均增加（均P＜0.05），Lee’s 指数上升（P＜0.01）；与模型对照组比较，降浊合剂组的白色脂肪质量和白色脂肪系数均明显减少（均P＜0.01），Lee’s 指数下降（P＜0.01），见表2。结果提示，降浊合剂能够减少肥胖鼠高脂饮食导致的体脂增加。

建立多元供应体系，大力推进煤炭清洁高效利用，着力发展非煤能源，形成煤、气、油、可再生能源多轮驱动的能源供应体系。

表2 三组体脂系数比较Table 2 Body fat coefficient in the three groups of rats（±s）

表2 三组体脂系数比较Table 2 Body fat coefficient in the three groups of rats（±s）

与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，##P＜0.01.

组 别正常对照组模型对照组降浊合剂组Lee’s指数295.69±7.76 305.69±9.07**295.33±5.23##n 10 10 10白色脂肪质量（g）12.55±3.22 16.91±2.84**11.02±2.31##白色脂肪质量系数2.43±0.56 2.97±0.55*2.14±0.45##棕色脂肪质量（g）0.54±0.14 0.53±0.13 0.55±0.05棕色脂肪质量系数0.11±0.03 0.09±0.02 0.11±0.01

2.3 降浊合剂对肥胖鼠脂肪中PRDM16、UCP1的mRNA和蛋白表达的影响

与正常对照组比较，模型对照组白色脂肪和棕色脂肪中PRDM16、UCP1的mRNA 表达均减少（均P＜0.05）；与模型对照组比较，降浊合剂组棕色脂肪中PRDM16的mRNA 表达均增加（P＜0.05），白色脂肪中PRDM16，棕色脂肪和白色脂肪中UCP1 的mRNA 表达也有增加趋势，但差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表3。提示降浊合剂可以提高棕色脂肪和白色脂肪中PRDM16、UCP1的mRNA表达水平。

表3 三组白色和棕色脂肪中PRDM16、UCP1 mRNA表达比较Table 3 Effect of Jiangzhuo mixture on mRNA expression of PRDM16 and UCP1 in white and brown fat of obese rats（± s）

表3 三组白色和棕色脂肪中PRDM16、UCP1 mRNA表达比较Table 3 Effect of Jiangzhuo mixture on mRNA expression of PRDM16 and UCP1 in white and brown fat of obese rats（± s）

与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.05.PRDM:PR结构域蛋白；UCP:解偶联蛋白.

组 别正常对照组模型对照组降浊合剂组n PRDM16棕色脂肪1.00±0.11 0.54±0.12**0.82±0.03#UCP1棕色脂肪1.00±0.12 0.67±0.17*0.83±0.08白色脂肪1.00±0.12 0.63±0.15*0.67±0.12 10 10 10白色脂肪1.00±0.11 0.63±0.15*0.79±0.20

白色和棕色脂肪中PRDM16 蛋白表达量模型对照组［（0.15±0.02）和（0.26±0.02）］比正常对照组［（0.25±0.17）和（0.61±0.05）］均减少（均P＜0.01），降浊合剂组［（0.20±0.02）和（0.51±0.03）］比模型对照组均增加（均P＜0.05），见图1。白色和棕色脂肪中UCP1 蛋白阳性染色部位的面积占总视野面积的百分比模型对照组［（10.84±1.51）%和（51.74±4.03）%］比正常对照组［（15.06±1.97）%和（83.20±6.38）%］均减少（均P＜0.01）；降浊合剂组［（14.72±1.38）%和（76.12±6.23）%］比模型对照组均增加（均P＜0.05），见图2。提示降浊合剂能够明显增加白色脂肪和棕色脂肪中RDM16 蛋白表达量；增加UCP1蛋白阳性面积，减小脂肪细胞。

图1 三组白色和棕色脂肪组织中PRDM16 蛋白表达电泳图Figure 1 Electrophoresis of PRDM16 protein expression in white and brown adipose tissue of rats in each group

图2 三组白色和棕色脂肪组织中UCP1 蛋白免疫组织化学染色结果Figure 2 Results of immunohistochemical staining of UCP1 protein in white and brown adipose tissue of rats in each group

2.4 降浊合剂对模型鼠白色脂肪组织TLR4/IκBα/NF-κB信号通路的影响

TLR4、磷酸化IκBα 和NF-κB-p65 蛋白表达模型对照组比正常对照组增加（均P＜0.01），而降浊合剂组比模型对照组减少（均P＜0.05），见图3、表4。结果提示，降浊合剂可以降低TLR4、磷酸化IκBα 和NF-κB-p65蛋白表达水平，抑制TLR4/IκBα/NF-κB 信号通路。

图3 三组TLR4、磷酸化IκBα、NF-κB 蛋白表达电泳图Figure 3 Electrophoresis of TLR4， phosphorylated IκBα and NF-κB proteins in each group

表4 三组TLR4、磷酸化IκBα、NF-κB蛋白表达水平比较Table 4 TLR4， phosphorylated IκBα， NF-κB protein expression in each group（± s）

表4 三组TLR4、磷酸化IκBα、NF-κB蛋白表达水平比较Table 4 TLR4， phosphorylated IκBα， NF-κB protein expression in each group（± s）

与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.05.TLR:Toll样受体；NF-κB:核因子κB；IκBα:NF-κB抑制蛋白α.

NF-κB-p65 1.00±0.12 3.63±0.37**2.88±0.29#组 别正常对照组模型对照组降浊合剂组n 10 10 10 TLR4 1.00±0.09 2.60±0.23**2.15±0.18#磷酸化IκBα 1.00±0.12 3.87±0.35**3.15±0.29#

3 讨 论

近年研究发现，黄芪、绞股蓝、丹参、生苍术、山楂、荷叶等中药材可以增加哺乳动物能量消耗、减少脂肪积累［12-17］。本研究采用以上中药材制成降浊合剂，探究该组方对肥胖大鼠关键转录因子的影响。

研究先分析了降浊合剂对肥胖SD 大鼠Lee’s指数和脂肪质量的影响。Lee’s 指数是评价成年大鼠肥胖程度的有效指数［18］。本文资料显示，降浊合剂可以有效缓解高脂饮食诱导的SD 大鼠Lee’s指数和白色脂肪质量系数升高，说明降浊合剂可以改善SD 大鼠的肥胖。此外，当动物机体受到刺激时，生化指标作为血液成分可随着疾病的程度发生相应的变化［19］。本文资料显示，降浊合剂可以缓解高脂饮食导致的大鼠血糖、总胆固醇、三酰甘油、LDL-C 含量升高，可能是因为降浊合剂能增加机体对脂肪的分解和代谢，从而减轻肥胖、降低血脂。因此，本文进一步研究了降浊合剂对肥胖大鼠棕色和白色脂肪含量的影响。

肥胖的特征是棕色和白色脂肪代谢含量失调，通常表现为白色脂肪增多而棕色脂肪细胞减少。目前，对抗肥胖的策略已经从防止脂肪积累转向通过激活棕色脂肪组织和白色脂肪组织的褐变来促进能量消耗［20］。棕色和白色脂肪细胞都属于产热脂肪，且均富含线粒体并表达UCP1［21］。UCP1 可将电子传递链从能量生产中解耦，导致热能的释放。此外，有研究发现了新的棕色脂肪特异性标志物，如PRDM16，已被用于识别棕色脂肪刺激剂［22］。因此，控制UCP1 和PRDM16 的表达对治疗肥胖具有重要的临床意义。研究表明，丹参、苍术等制成的津力达中药颗粒在治疗高脂饮食的小鼠时可明显提高其棕色脂肪组织中UCP1 蛋白的表达［23］；黄芪散可通过促进UCP1 和PRDM16 表达缓解2 型糖尿病模型大鼠伴随的肥胖症状［24］。此外，促进UCP1 的表达可以使白色脂肪棕色化，进而增加能量消耗，减轻体重［25］。本文资料显示，降浊合剂能够明显促进白色、棕色脂肪中PRDM16、UCP1 的表达，证实降浊合剂的组方成分在调节肥胖机体转录相关因子中具有良好的效力，但其具体作用机制还须进一步研究。

综上所述，本研究结果证实降浊合剂可以调节与肥胖相关的关键信号通路TLR4/IκBα/NF-κB，调节肥胖相关指标的表达以及降低脂肪组织的产生，从而降低肥胖大鼠的体重、体脂，改善肥胖的临床特征。

志谢 研究得到宁波市科技计划项目（2019A610359）、宁波市医疗卫生品牌学科建设项目（PPXK2018-07）支持

Acknowledgements The work was supported by the Science and Technology Project of Ningbo City (2019A610359) and Medical and Health Brand Discipline Construction Project of Ningbo City (PPXK2018-07)

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of Interests The authors declare that there is no conflict of interests

©The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)