分光光度法测定海水中叶绿素a 的方法研究

石文静 施巍 王宁 张雷

（辽宁省大连生态环境监测中心，辽宁 大连 116000）

1 引言

水体富营养化（eutrophication）是指在人类活动的影响下，生物所需的氮磷等营养物质大量进入湖泊、河湖、海湾等缓流水体，引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖，导致水体溶解氧含量下降，引起水质恶化，从而造成鱼类及其他生物大量死亡的现象。在自然条件下，也会发生湖泊从贫营养状态逐步过渡到富营养状态的现象，一般自然界中的这种过程通常非常缓慢。但是随着工业的发展，人为排放的含有各类营养物质的工业废水以及生活污水引起的水体富营养化却可以在极短时间内发生。当水体出现富营养化时，生物表现形式为藻类大量繁殖，从而形成水华或赤潮现象（通常淡水富营养化称为水华，海水富营养化则称为赤潮）。通常来讲，叶绿素a 是评价水体富营养化的一个重要参数，所以叶绿素a 的各项实验室指标以及分析方法就非常重要。根据GB 17378.7—2007《海洋监测规范》［1］规定，我国海水叶绿素a 的监测方法分为荧光分光光度法和分光光度法两种，但现有标准中这两种方法都没明确检出限、精密度和准确度等方法特征性指标，实验室查阅多篇相关文献并没有获得海水监测中相关数据，但在实际工作中以及填报监测数据时却经常会要求填报方法检出限之类的数据，所以本文以GB 17378.7—2007《海洋监测规范》、HJ 168—2020《环境监测分析方法标准制订技术导则》［2］、HJ 897—2017《水质叶绿素a 的测定分光光度法》［3］和《水和废水监测分析方法》（第四版）［4］为依据，参考地表水中叶绿素a的方法研究等文献材料［5］，通过试验确立分光光度法分析海水中叶绿素a 的实验室检出限、精密度和准确度等特征性指标数据，以方便日常工作数据填报，并为其他实验室分析人员提供参考。

2 材料与方法

实验室参照GB 17378.7—2007《海洋监测规范》中分光光度法对实验室分析条件的要求以及HJ 168—2020《环境监测分析方法标准制订技术导则》中对分析项目检出限、准确度以及精密度的相关规定，开展针对海水中叶绿素a 的分析检测，记录实验结果并参照《水和废水监测分析方法》（第四版）以及HJ 168—2020《环境监测分析方法标准制订技术导则》中对分析项目检出限、准确度以及精密度的相关计算方法，对实验数据进行计算并汇总。

2.1 仪器与试剂

参照GB 17378.7—2007《海洋监测规范》中分光光度法监测叶绿素a 的实验室分析条件。

仪器：分光光度计；0.45 μm 玻璃纤维滤膜；具塞离心管。

试剂：叶绿素a 标准样品（编号KCG6922）；90%丙酮溶液；碳酸镁悬浮液（10 g/L）。

2.2 实验方法

按照GB 17378.7—2007《海洋监测规范》中分光光度法监测叶绿素a 的实验室分析条件。

2.2.1 样品制备

利用量筒准确量取一定量海水样品，加入3 mL碳酸镁悬浮液，并混匀。混匀后样品用0.45 μm 玻璃纤维滤膜过滤，过滤负压不应超过50 kPa。

2.2.2 样品提取

将样品制备中过滤样品后得到的玻璃纤维滤膜放入具塞离心管中，迅速加入10 mL 丙酮溶液并摇荡，随后放冰箱储存室中储存14～24 h 后取出离心提取，选择离心机离心速度3 000～4 000 r/min、离心时间10 min。

2.2.3 样品测定

取离心后的上清液于1 cm 比色皿中，利用分光光度计对上清液进行扫描分析，分析过程中利用空白丙酮溶液作参比溶液，分别记录分光光度计750，664，647，630 nm 4 个波长处所测得的吸光值。需要注意的是，当分光光度计波长在750 nm 处，1 cm比色皿吸光度超过0.005 时，参与分析的提取液需要重新离心再进行分光光度比色分析。

3 结果与分析

参照《水和废水监测分析方法》（第四版）中相关规定以及HJ 168—2020《环境监测分析方法标准制订技术导则》中对分析项目检出限、准确度以及精密度的相关规定，本试验分别对海水中叶绿素a 进行关于检出限、准确度以及精密度等实验室指标统计计算。

3.1 检出限

对浓度为0.1 mg/L 的海水叶绿素a 标准品进行测定，并计算7 次平均测定的标准偏差，按照下面公式计算海水叶绿素a 的方法检出限：

式中，MDL 为方法检出限；n 为样品的平行测定次数；t 为自由度为n-1、置信度为99%时的t 分布（单侧，n=7 时，t=3.143）；S 为n 次平行测定的标准偏差。测定结果见表1。

表1 检出限测定结果mg/L

由表1 中7 个检测结果计算得出检出限为0.018 mg/L，从而可以计算出：当实验室丙酮使用液体积为10 mL、采样体积为1 000 mL 时，海水中叶绿素a 的实验室检出限为0.18 μg/L。

3.2 准确度

实验室采取加标回收率的方法来考察分光光度法检测海水中叶绿素a 的方法准确性。采取对2 个浓度的实际样品加标的方法来考察方法的准确度，加标方法为对实际海水样品抽滤后加入叶绿素a 标准溶液，按照GB 17378.7—2007《海洋监测规范》中分光光度法对样品进行分析，分析结果见表2。由表2 可以看出，2 个浓度的海水实际样品加标回收率分别为85.4%和82.7%。

表2 准确度测定结果

3.3 精密度

对不同浓度的海水实际样品进行平行测定6次，并计算相对标准偏差，考察分光光度法检测海水中叶绿素a 的方法精密度，实验分析结果见表3。由表3 可以看出，分光光度法检测海水中叶绿素a 的方法相对标准偏差为0.8%～4.4%。

表3 准确度测定结果

4 结果与讨论

由以上实验可以得出结论，利用分光光度法分析海水中叶绿素a 时，当丙酮使用液体积为10 mL、海水采样体积为1 000 mL 时，本实验利用分光光度法进行的海水中叶绿素a 分析的方法检出限为0.18 μg/L，海水中叶绿素a 实际样品加标回收率为85.4%和82.7%，实验室精密度为0.8%～4.4%。

总结本实验过程的注意事项和关键点为：（1）海水样品在进行实验室叶绿素a 分析之前必须摇匀再进行其他实验室操作步骤；（2）如果实验过程中当分光光度计波长在750 nm 处，1 cm 比色皿的吸光度超过0.005 时，参与分析的叶绿素a 提取液应重新离心再参与分析检测；（3）由于叶绿素a 具有对光敏感的特性，所以实验室进行海水中叶绿素a 实验的全过程都应该在微光照条件下操作，并且实验中所使用的标准溶液要严格避光保存。