植物乳杆菌素LPL-1的异源表达及理化性质分析

王 玉，王 瑶，李平兰

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

近年来，抗生素的过度使用，导致在多种食物中检测到抗生素耐药菌的存在，对人类健康造成潜在威胁[1-2]，故开发不易产生耐药性的天然生物防腐剂具有重要意义。乳酸菌细菌素是菌体代谢时，经核糖体机制产生的具有抗菌活性的多肽或前体多肽[3]。与抗生素不同，乳酸菌细菌素不仅对食源性致病菌具有抗性，且在自然状态下，不易出现细菌素耐药性菌株[4]。根据乳酸菌细菌素生化和遗传特性的不同，将其主要分为3 类[5-6]：I类为羊毛硫细菌素；II类为含有热稳定、不含羊毛硫氨酸的肽，可细分为4 个亚类；III类为对热敏感的大分子蛋白质物质。目前对I类、IIa类的乳酸菌细菌素研究较为广泛，其中I类细菌素中的Nisin是唯一被商业许可的乳酸菌细菌素，已在50多个国家授权使用，但因其pH值耐受性较差而应用受限[7-8]。IIa类细菌素因其分子质量小，除二硫键形成之外无其他翻译后修饰，对单核细胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）具有强烈抑菌活性，有良好的pH值稳定性，易被人体内蛋白酶降解等特点，已成为天然食品防腐剂研究与开发的热点[9-10]。

目前，IIa类细菌素主要通过天然生物合成获得，但因受到机体调控系统的影响，其产量往往较低，严重制约了工业化生产及应用[11]。大肠杆菌（Escherichia coli）表达外源蛋白具有成本低、周期短、产率高等优点[12]，因此，开展IIa类细菌素在E.coli中的表达研究具有重要实践意义。E.coli胞质处于还原性状态，在这种状态下二硫键难以形成或稳定存在[13]，因此IIa类细菌素在E.coli中的异源表达多以包涵体形式存在。目前，已有研究报道可以将IIa类细菌素与大分子标签蛋白融合表达以改变包涵体形式。例如，Wang Qing等[14]在E.coliBL21（DE3）中将细菌素E50-52与泛素融合表达后，切除泛素标签获得具有活性的细菌素；Chen Haiqin等[15]将细菌素NB-C1与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）在E.coli无细胞蛋白质系统融合表达，然后通过切除GFP标签获得具有活性的细菌素；同样地，以类似的方法在E.coli中实现了Plantaricin 423和Mundticin ST4SA可溶性表达[16]。以上方式虽然可以解决IIa类细菌素在E.coli中的包涵体表达问题，但都需要通过切除融合标签实现活性，不仅增加了纯化步骤，而且增加了工业生产成本。已有研究报道可以利用基因编辑技术，将E.coli过氧化物酶基因（ahpC）突变，同时将硫氧还蛋白还原酶基因（trxB）、谷胱甘肽还原酶基因（gor）敲除，以此降低E.coli胞质中的氧化还原电势，促使含有二硫键的蛋白折叠形成正确的空间结构[17]。

本实验室前期从发酵鱼中筛选得到1 株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LPL-1，其所产细菌素为新的IIa类细菌素，因含有2 个二硫键，该细菌素不仅对李斯特菌表现出强烈抑菌活性，而且具有良好的稳定性，具有作为天然食品生物防腐剂的应用潜力[18-19]。本研究以植物乳杆菌素LPL-1为研究对象，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术改变E.coli细胞质中的还原环境构建适宜IIa类细菌素表达的细胞工厂，产生的细菌素不需要通过切除融合标签实现活性，可以优化细菌素的纯化步骤，解决植物乳杆菌素LPL-1在E.coli中的包涵体表达问题，旨在为IIa类细菌素的异源表达及包涵体问题提供了新的解决策略。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L.plantarumLPL-1分离自中国传统发酵鱼；L.monocytogenesATCC 54002为本实验室保存；E.coliBW25331、E.coliDH5α 天根生化科技（北京）有限公司。

表达载体pWL-A为本实验室保存；pCAS和pTargetF质粒 长沙艾碧维生物科技有限公司；限制性内切酶、PrimeSTAR DNA聚合酶、In-Fusion试剂盒 宝日医生物技术有限公司；MRS、LB和自诱导培养基各组成分西陇科学股份有限公司。

1.2 仪器与设备

DNP-9162恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；SCL-1300垂直洁净工作台 北京赛伯乐实验仪器有限公司；XQ-LS-S高压蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司；超声波破碎仪 宁波新芝生物技术股份有限公司；聚合酶链式反应 力新仪器（上海）有限公司；恒温金属浴、紫外检测仪 上海沪析生物技术有限公司；Ni-NTA纯化柱 金斯瑞生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 gRNA质粒的构建

通过http://crispor.tefor.net/设计敲除基因的前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）序列。以pTargetF为模板，采用全质粒聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法将设计出的PAM序列加入质粒pTargetF中。使用引物对trxB-F/trxB-R、gor-F/gor-R、ahpC-F/ahpC-R进行全质粒PCR，对PCR产物进行DpnI消化处理，纯化后转化E.coliDH5α，挑选单克隆测序验证，得到的质粒分别命名为gRNA-trxB、gRNA-gor、gRNA-ahpC。引物序列如表1所示。

表1 实验所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3.2 打靶片段的构建

以E.coilBW25331基因组为模板，trxB-up-F、trxBup-R为引物，PCR扩增获得基因trxB的上游片段，以trxBdown-F、trxB-down-R为引物，PCR扩增获得基因trxB的下游片段，以trxB-up-F、trxB-down-R为引物，trxB的上游片段和下游片段为模板，用重叠延伸PCR法获得trxB的打靶片段。以同样方法构建gor和ahpC的打靶片段。引物序列如表1所示。

1.3.3 基因敲除菌株的构建

利用化学转化法将pCAS质粒转入E.coilBW25331中，挑选含有正确转化子的菌株，按Jiang Yu等[20]的方法制备含有pCAS质粒的E.coilBW25331（pCAS）感受态。trxB基因的敲除：将100 ng gRNA-trxB质粒、400 ngtrxB打靶片段与50 μL感受态细胞混匀，转入预冷的0.2 cm电转杯，电击后加入预热的LB培养基，30 ℃复苏2 h，涂布至含有卡那霉素（50 mg/L）和壮观霉素（50 mg/L）的LB琼脂培养基上，30 ℃培养过夜。用验证引物trxB-Identi-F、trxB-Identi-R（表1）对转化子进行PCR扩增，测序验证，检测trxB基因是否敲除成功。gor基因的敲除和ahpC基因的突变，方法同上。

1.3.4 质粒pTargetF和pCAS的消除

按照Jiang Yu等[20]描述的方法进行pTargetF和pCAS质粒的消除，将鉴定正确的重组菌培养在含有50 mg/L卡那霉素和0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB液体培养基中，培养8～16 h后涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB平板上继续培养，根据菌株对壮观霉素敏感性的变化确认gRNA质粒是否消除。将消除gRNA质粒的菌株在37 ℃的LB培养基中培养，以消除pCAS质粒。

1.3.5 重组表达质粒的构建

根据植物乳杆菌素LPL-1基因序列设计引物LPL-F、LPL-R（表1），以植物乳杆菌LPL-1基因组为模板，使用PrimeSTAR DNA聚合酶扩增植物乳杆菌素的编码基因。PCR体系：模板50 ng，2×PrimeSTAR 25 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），添加ddH2O至50 μL；PCR条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环；72 ℃延伸10 min。将基因片段采用1.5%的琼脂糖凝胶回收。

利用NcoI和XhoI酶切表达质粒pWL-A，纯化试剂盒回收酶切后的质粒，利用In-Fusion试剂盒将回收的质粒与扩增的植物乳杆菌素LPL-1基因片段进行连接。连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞中，菌落经PCR筛选阳性克隆并进行测序验证。

1.3.6 重组植物乳杆菌素LPL-1的表达和纯化

将植物乳杆菌素LPL-1表达质粒转化至E.coliBW25113和构建的其余基因敲除菌中，于固体平板挑取单菌落于5 mL LB液体培养基，37 ℃、230 r/min培养至OD600nm=0.4。按照0.5%的接种量转接至100 mL自诱导液体培养基[21]，37 ℃、230 r/min培养12 h；5000 r/min离心10 min收集菌体，5 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）重悬，超声波破碎菌体（功率30%、破碎3 s、间隙2 s，工作时间10 min），收集上清液与沉淀，用Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）[22]分析目的蛋白的表达情况。

收集含有重组蛋白的上清液，经0.45 μm滤膜过滤后装入Ni-NTA纯化柱，在220 nm下对蛋白进行检测。用5～10 倍柱床体积的PBS（含10 mmol/L咪唑）洗去未结合的蛋白。之后用PBS（含300 mmol/L咪唑）洗脱带有His标签的重组蛋白，流速为1 mL/min，收集洗脱峰，Tricine-SDS-PAGE分析目的蛋白的纯化情况，1 kDa超滤管对目标峰蛋白脱盐浓缩。

1.3.7 重组植物乳杆菌素LPL-1抑菌活性的检测

采用琼脂扩散法[23]检测重组植物乳杆菌素LPL-1的抑菌活性，每孔添加量为100 μL。将纯化的细菌素进行2 倍稀释，取100 μL进行抑菌实验，检测不到抑菌圈出现的最高稀释度定义为一个活力单位（1 AU），其倒数即细菌素的相对抑菌效价（AU/mL），以肉眼观察到的产生抑菌圈的最低浓度为重组植物乳杆菌素LPL-1对指示菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.3.8 重组植物乳杆菌素LPL-1的生化特性分析

1.3.81 温敏性

将纯化的植物乳杆菌细菌素LPL-1置于60、80 ℃与100 ℃，处理15 min和30 min，恢复室温后，检测其抑菌活性变化。以未处理组（25 ℃）为对照，计算细菌素活性保留百分比。

1.3.82 pH值稳定性

用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液将纯化的植物乳杆菌素LPL-1 pH值调节至2～11，37 ℃孵育2 h后，调回细菌素pH 6.0，检测其抑菌活性变化。以pH 6为对照，计算细菌素活性保留百分比。

1.3.83 表面活性剂稳定性

将纯化的植物乳杆菌细菌素LPL-1分别与1%的乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、Tween-20、Tween-80和尿素混合，37 ℃孵育2 h，检测其抑菌活性变化。以未处理组为对照，计算细菌素活性保留百分比。

1.4 数据处理与分析

采用Excel软件对原始数据进行整理，采用GraphPad Prism软件对实验数据进行单因素方差分析及绘图，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 重组植物乳杆菌素LPL-1的表达载体构建

L.plantarumLPL-1基因组信息显示，植物乳杆菌素LPL-1基因大小为126 bp，用引物LPL-F、LPL-R扩增得到的植物乳杆菌素LPL-1基因片段大小在100～250 bp之间（图1），连接至pWL-A表达载体，对重组子进行测序验证，得到含有正确克隆的表达载体pWL-A-LPL-1，可用于后续的蛋白表达。

2.2 基因敲除菌株的构建

2.2.1 基因敲除菌株E.coil（ΔtrxB）和E.coil（Δgor）的构建

构建的trxB-gRNA与trxB打靶片段成功转入含有pCAS质粒的E.coilBW25331菌株中。trxB基因长度为966 bp，用横跨trxB基因500 bp的上下游引物进行鉴定，正确敲除trxB后，扩增产物为500 bp，未敲除trxB基因扩增产物长度为1466 bp；以同样的方法对gor基因进行敲除和鉴定，基因gor长度为1353 bp，gor基因敲除后，扩增产物长度为500 bp，gor未敲除扩增产物长度为1853 bp。通过核酸电泳（图2）分析发现，基因trxB与gor敲除成功，基因测序后未发现基因突变，因此得到敲除菌株E.coil（ΔtrxB）和E.coil（Δgor），可用于重组植物乳杆菌素LPL-1的表达。

图2 基因敲除菌株E. coil（ΔtrxB）和E. coil（Δgor）构建的菌落PCR鉴定图Fig.2 Colony PCR identification of gene knockout strains E. coil(ΔtrxB) and E. coil (Δgor)

2.2.2 基因敲除菌株E.coil（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）的构建

E.coli中氧化还原反应两个关键基因trxB和gor同时缺失会导致菌体死亡，而细胞质内ahpC基因突变（TTCTACCC→TTCTCTTACCC）可以减少过氧化氢和烷基氧化物的积累，保护细胞免受损伤，进而抑制菌体的死亡[24]。构建的ahpC-gRNA质粒与ahpC打靶片段成功转入含有pCAS质粒的E.coilBW25331菌株中。通过基因测序（图3），成功筛选到含有正确突变体的目标菌株。在此突变株基础上分别对trxB和gor基因进行敲除，最终成功得到基因敲除菌株E.coil（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM），可用于重组植物乳杆菌素LPL-1的表达。

图3 基因ahpC点突变前后比对图Fig.3 Comparison of target gene ahpC before and after mutation

2.3 重组植物乳杆菌素LPL-1的表达分析

构建成功的表达载体pWL-A-LPL-1分别转化至E.coliBW25113、E.coil（ΔtrxB）、E.coil（Δgor）和E.coil（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）进行表达分析，将诱导表达后的菌体进行超声破碎，利用Tricine-SDS-PAGE对超声破碎后的上清液与沉淀进行分析，由图4可知，以E.coliBW25113为宿主时，只有沉淀中可观察到目的条带（5.2 kDa），由此说明植物乳杆菌素LPL-1在野生型菌株中主要以包涵体形式表达；植物乳杆菌素LPL-1以敲除菌株E.coil（ΔtrxB）和E.coil（Δgor）为表达宿主时，在上清液中可见痕量表达，但细菌素仍大量以包涵体形式存在于沉淀中；当细菌素在E.coil（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）中诱导表达时，可以明显观察到上清液中目的蛋白的表达量增多，由此说明构建的基因工程菌E.coil（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）有利于植物乳杆菌素LPL-1的正确折叠，促进了细菌素的可溶性表达，进一步以该菌株为表达宿主，对上清液中的植物乳杆菌素LPL-1进行纯化与活性分析。

图4 植物乳杆菌素LPL-1于E. coli BW25113（A）、E. coil（ΔtrxB）（B）、E. coil（Δgor）（C）和E. coil（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）（D）中表达的Tricine-SDS-PAGE分析Fig.4 Tricine-SDS-PAGE analysis of the expression of plantaricin LPL-1 in E. coli BW25113 (A),E. coil (ΔtrxB) (B), E. coil (Δgor) (C) and E. coil (ΔtrxB +Δgor+ahpCM) (D)

2.4 重组植物乳杆菌素LPL-1的纯化

如表2和图5所示，细菌裂解上清液的比活力为193.26 AU/mg，重组植物乳杆菌素LPL-1带有His标签可以用Ni-NTA柱进行纯化，经10 mmol/L咪唑洗脱杂蛋白，300 mmol/L咪唑洗脱目的蛋白，共出现两个洗脱峰，利用Tricine-SDS-PAGE对峰1和峰2进行分析，重组蛋白的分子质量为5.2 kDa，在峰2大量出现且纯度较高。收集峰2的目的蛋白进行抗菌活性验证，其比活力为2542.35 AU/mg。超滤管对峰2目的蛋白脱盐处理后的比活力为2690.62 AU/mg。虽然纯化后的重组细菌素比活力不如天然植物乳杆菌素LPL-1（5541.66 AU/mg），但其回收率却远超天然细菌素（2.08%）和需要切除融合标签的重组细菌素（5.75%）[19]，这可能是由于重组细菌素含有His标签，一定程度影响细菌素的活性，但因避免了繁琐的纯化步骤，所以提高了回收率。

图5 E. coli BW25113（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）外源表达的植物乳杆菌素LPL-1 Ni-NTA柱纯化（A）、纯度（B）及对L. monocytogenes的抑菌活性（C）Fig.5 Purification (A),purity (B) and antibacterial activity (C) of plantaricin LPL-1 from E. coli BW25113 (ΔtrxB+Δgor +ahpCM) by Ni-NTA column

表2 植物乳杆菌素LPL-1的纯化Table 2 Purification of plantaricin LPL-1

2.5 重组植物乳杆菌素LPL-1的抗菌谱分析

如表3所示，重组植物乳杆菌素对L.monocytogenes、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌等革兰氏阳性菌表现出明显抑菌活性，与天然植物乳杆菌素[19]和其他植物乳杆菌中分离的IIa类细菌素[24]一致，重组细菌素不能抑制革兰氏阴性菌和真菌的生长。以上结果说明用此方法表达的重组细菌素能够很好地保留天然细菌素的抑菌特性。

表3 重组植物乳杆菌素LPL-1抑菌谱Table 3 Antimicrobial spectrum of recombinant plantaricin LPL-1

2.6 重组植物乳杆菌素LPL-1的生化特性分析

2.6.1 温度对重组植物乳杆菌素LPL-1的影响

细菌素对温度的敏感性强弱是衡量其在食品行业潜在应用价值的标准。由图6A可知，外源表达的植物乳杆菌素LPL-1在60 ℃分别处理10 min与30 min后，其抗菌活性可以保持90%以上，经80 ℃分别处理10 min与30 min，抗菌活性可以保持80%以上，经100 ℃分别处理10 min与30 min，抗菌活性可以保持65%以上，与天然合成的植物乳杆菌素LPL-1[19]和植物乳杆菌素J23[25]相似，说明该重组细菌素具有很好的热稳定性，在巴氏灭菌及需要高温灭菌的食品中具有一定的应用潜力。

图6 温度（A）、pH值（B）和表面活性剂（C）对植物乳杆菌素LPL-1活性的影响Fig.6 Effects of temperature (A),pH (B) and surfactant (C) on the activity of plantaricin LPL-1

2.6.2 pH值对重组植物乳杆菌素LPL-1的影响

不同细菌素适用的pH值范围不同，大多数乳酸菌细菌素在低pH值条件下抑菌活性最高，在pH 7以上时，抑菌活性减弱或丧失[26]。例如，Nisin在酸性条件下抑菌效果最好，但在中性或碱性条件下活性丧失[27]。而重组植物乳杆菌素LPL-1与天然合成的植物乳杆菌素LPL-1[19]和其他植物乳杆菌素[28]相似，在pH 2～7范围内仍保持90%以上活力（图6B），pH 8～10范围内仍保持50%～70%的活力，说明该细菌素具有非常好的pH值稳定性，在酸性、中性及弱碱性食品中具有一定的应用潜力。

2.6.3 表面活性剂对重组植物乳杆菌素LPL-1的影响

表面活性剂常用作食品乳化剂应用于食品工业中[29]。由图6C可以看出，尿素、EDTA、Tween-20和Tween-80对重组植物乳杆菌素LPL-1的抗菌活性影响很小，均可以保持90%以上的抗菌活性，与天然合成的植物乳杆菌素LPL-1和植物乳杆菌素K25[30]类似，由此说明重组细菌素在乳化食品中具有一定应用潜力。

3 结论

IIa类细菌素是乳酸菌细菌素中规模最大、研究最广泛的一个类别[31]，由于其稳定的理化性质和对食源性致病菌的强抑菌活性，已成为生物防腐剂中最有希望的候选物[10]。天然IIa类细菌素产量低且不易于分离纯化，以E.coli为宿主表达时，由于其二硫键的存在又极易形成包涵体。

本研究通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术以E.coliBW25331为底盘菌株，构建了3 种不同基因型的表达宿主。植物乳杆菌素LPL-1在野生型E.coliBW25331中主要以包涵体形式出现；在E.coliBW25113（ΔtrxB）与E.coliBW25113（Δgor）中以可溶性形式痕量出现于上清液中，但多数仍以包涵体形式存在；当植物乳杆菌素在E.coliBW25113（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）中表达时，在上清液中观察到大量细菌素的出现，由此解决了植物乳杆菌素LPL-1的包涵体表达问题。将外源表达的植物乳杆菌素LPL-1经镍柱纯化后，得到的重组细菌素与天然细菌活性相似，在不同pH值（2～11）、温度（60～100 ℃）及表面活性剂处理后仍保持较高的活性，并对多种食源性致病菌具有抑菌活性，说明外源表达的植物乳杆菌素LPL-1在食品领域具有非常广泛的应用潜力。

本研究对IIa类细菌素异源表达的探索以及理化特性分析可为细菌素的工业化生产及其在食品安全领域应用提供一定数据支持。