多组学技术融合电子感官的咖啡风味品质分析

李钰莲，郑建祎，黄旭辉，董秀萍，赵保民，秦 磊,*

（1.大连工业大学食品学院，国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁 大连 116034；2.江苏派乐滋食品有限公司，江苏 徐州 221112）

咖啡豆是茜草科咖啡属植物的种子[1]，原产地为埃塞俄比亚，经处理后能制成世界三大无酒精的饮品之一——咖啡[2]。咖啡含有多种生物活性成分，具有提神醒脑、抗氧化等作用[3]。随着国民生活水平的提升，咖啡文化日渐兴起，促进了咖啡消费[4]，使中国咖啡市场处于高速发展阶段，预计行业保持27.2%的增长率上升，2025年中国咖啡市场规模将达10000亿 元[5]。

咖啡独特的醇香口感、色泽和风味是由生豆烘焙后发生美拉德、焦糖化等化学反应形成的[6]。Hartman将“风味”定义为把食物放在口腔中及咀嚼时所产生的嗅觉（香味）和味觉（滋味）的一种整体感觉[7]。之前对咖啡风味的评价以感官评定为主，但由于主观因素、不可重复性等缺点，并不能客观有效地进行评价[8]。而电子鼻、电子舌系统能够分别从香味及滋味两个不同的角度对风味轮廓进行快速检测。董文江等[9]利用电子鼻和电子舌技术评价不同干燥温度下烘焙咖啡豆气味和滋味的差异性，发现二者均能够有效区分日晒干燥及不同热泵干燥温度处理所得的烘焙咖啡豆。

咖啡风味受品种、烘焙条件等因素影响，主要由挥发性风味成分和非挥发性呈味成分两部分组成[10]。风味组学通过分析样品中的挥发性物质，全面反映风味整体变化，采用多元统计分析筛选关键风味标记物[11]。陆羽霜等[12]利用固相微萃取-气相色谱-质谱（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）联用技术在不同烘焙度的咖啡萃取液中共鉴定出74 种挥发性物质，并分别得到对各类香气贡献率最大的物质。而对于咖啡中非挥发性呈味组分如多糖、生物碱类[10]的研究相对较少。超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）与Q-Exactive HF-X质谱仪联用具有极高的灵敏度、分辨率和质量精度[13]，能够有效用于咖啡中非挥发性呈味组分及其挥发性香味组分前体物质的检测分析[14]。代谢组学检测到的化合物数量巨大，而风味组学则与消费者的喜好进行对接[15]。咖啡中大量的代谢组分，与风味组学方法相结合可挖掘与咖啡风味品质相关的化合物，进而得到其标志物。

本研究以6 种不同烘焙度及咖啡豆配比的咖啡产品作为研究对象，通过SPME-GC-MS分析挥发性组分，通过UPLC-MS/MS检测代谢小分子，辅以电子鼻及电子舌的电子感官技术相结合探明不同样品香味和滋味的差异性，对咖啡风味品质进行综合性评价，筛选出不同类型咖啡的标志物，为工业化生产的品质控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同烘焙度及不同产地咖啡豆配比的速溶咖啡由江苏派乐滋食品有限公司提供。6 种咖啡均采用0～4 ℃加压冷萃取，并用-50 ℃极速冻干得到冻干咖啡粉，以K1～K6代称：K1为浅度烘焙（30%），咖啡配比为埃塞俄比亚西达摩60%和云南特高海拔精品咖啡40%；K2为浅度烘焙（40%），咖啡配比为埃塞俄比亚西达摩60%和云南特高海拔精品咖啡40%；K3为中度烘焙，咖啡配比为埃塞俄比亚西达摩60%和云南特高海拔精品咖啡40%；K4为中深度烘焙，咖啡配比为埃塞俄比亚西达摩60%和云南特高海拔精品咖啡40%；K5为中深度烘焙，咖啡配比为埃塞俄比亚西达摩30%，云南特高海拔精品咖啡30%以及埃塞俄比亚吉玛40%；K6为中度烘焙，咖啡配比为埃塞俄比亚吉玛70%和耶加雪啡30%。

缬氨酸-酪氨酸-缬氨酸、D3-N-甲基-乙酰左旋肉碱、D3-DL-丙氨酸、CUDA 美国Sigma-Aldrich公司；D9-咖啡因、D3-甲基烟酰胺（标准品）加拿大TRC公司；D9-氧化三甲胺、D3-DL-天冬氨酸 加拿大CDN isotopes公司；D3-DL-谷氨酸（同位素标准品）美国剑桥CIL公司。所有标准品的纯度均大于98.5%。

1.2 仪器与设备

7890B/7010B GC-MS仪 安捷伦科技（中国）有限公司；Q-Exactive-HF-X UPLC-MS/MS 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；CF16RXII高速冷冻离心机 日本日立公司；DN-12A氮气吹干仪 天津市乐康科技有限公司；PEN3型电子鼻 德国Airsense公司。

1.3 方法

1.3.1 电子鼻检测

分别取6 种速溶咖啡粉各1.5 g于20 mL顶空瓶，加入5 mL纯净水，混匀，60 ℃孵育15 min，进行电子鼻检测。响应数据由1 s的间距得到，测量持续时间为100 s，空气空白持续时间60 s。实验采用电子鼻进行咖啡样品检测。电子鼻设备共有10 个传感器，各传感器的功能特性是对特定物质种类选择性灵敏，其对应如下：W1C苯类芳香成分；W5S氮氧化合物；W3C氨类芳香成分；W6S氢化物；W5C短链烷烃；W1S甲基类；W1W无机硫化物；W2S醇、醛及酮类；W2W有机硫化物芳香成分；W3S长链烷烃。

1.3.2 电子舌检测

分别取6 种速溶咖啡粉各1.4 g，加入300 mL常温纯净水，涡旋至完全溶解，5000 r/min离心10 min取上清液，过滤。滤液倒入样品杯，每杯容量约为40 mL。样品测试进行4 次循环。

1.3.3 风味组学检测

分别取6 种速溶咖啡粉各1.5 g于20 mL顶空瓶。SPME条件：采用50/30 μm DVB/Car/PDMS萃取纤维，60 ℃孵育20 min，萃取40 min后进行GC-MS分析[16]。

色谱条件：毛细管色谱柱型号为H P-5 m s（30 m×250 μm，0.25 μm）。升温程序：起始温度45 ℃维持3 min，以5 ℃/min的升温速度升温至250 ℃，维持10 min；进样口温度为250 ℃；载气流量为1 mL/min。

质谱条件：使用电子电离源，Scan扫描模式，质量扫描范围m/z40～400，电子能量70 eV，溶剂延迟设定为5 min。

1.3.4 代谢组学检测

分别称取6 种速溶咖啡粉各0.4 g，加入10 mL纯净水，涡旋30 s。冰温下取250 μL混合液于1.5 mL离心管中，加入750 μL混合溶液（甲醇∶异丙醇=1∶1，V/V），涡旋30 s，4 ℃静置30 min，20000×g离心10 min。取20 μL上清液浓缩离心至干燥。以缬氨酸-酪氨酸-缬氨酸、D3-N-甲基-乙酰左旋肉碱、D3-DL-丙氨酸、CUDA、D9-咖啡因、D3-甲基烟酰胺、D9-氧化三甲胺、D3-DL-天冬氨酸、D3-DL-谷氨酸标准品作为内标，甲醇和乙腈作为溶剂，配制复溶溶液，每个样品用100 μL复溶液进行复溶，涡旋10 s，20000×g离心10 min，取上清液进行测定[17]。3 次平行。

色谱条件：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1×150 mm，1.7 μm）。柱温45 ℃。流动相A为水，流动相B为体积分数95%乙腈溶液，均含有0.125%甲酸和10 mmol/L甲酸铵。洗脱梯度如下：0.00～2.00 min，0% A，100% B；2.00～7.70 min，0%～30% A，100%～70% B；7.70～9.50 min，30%～60% A，70%～40% B；9.50～10.25 min，60%～70% A，40%～30% B；10.25～12.75 min，70%～0% A，30%～100% B；12.75～17.00 min，0% A，100% B。进样量为1 μL，流速为0.4 mL/min。

质谱条件：采用电喷雾电离源，以正离子模式进行检测，其采集范围m/z60～900。鞘气流量为60%，辅助气流量为25%，吹扫气流量为2%。喷雾电压为3.6 kV，毛细管温度为380 ℃，辅助气体加热器温度为370 ℃。

1.4 数据处理

挥发性成分定性分析是通过NIST 14谱库检索比对，用归一法计算各化学成分的相对含量。数据使用Excel 2017计算、绘制雷达图。使用MS-DIAL 3.96整理、筛选UPLC与质谱联用的数据[18]。利用MetaboAnalyst 4.0进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和热图分析。相关性分析绘图在https://www.omicstudio.cn.完成，选用Duncan进行显著性方差分析；Spearman相关性分析各指标间关联性。

2 结果与分析

2.1 不同咖啡的气味轮廓分析

利用电子鼻对不同烘焙程度以及不同产地咖啡的风味轮廓进行快速检测分析，图1A结果表明，传感器W5S、W1W、W2W的响应值较大，这3 种传感器分别对氮氧化合物、有机硫化物和无机硫化物反应灵敏。各样品在W1W、W2W传感器响应值的差异更大，表明二者对咖啡挥发性气味的区分效果更好。6 种样品的雷达图轮廓相似，为分辨不同样品是否存在差异性，利用PCA模型降维后进一步分析，不同咖啡样品能够得到初步区分。丛莎等[19]利用电子鼻PCA将不同贮藏阶段的咖啡豆在二维得分投影图上区分开，各自聚为一类。如图1B所示，6 个样品分为3 组，各组整体轮廓较为接近。K1～K4样品具有相同的咖啡配比，烘焙程度依次增加。K1与K2咖啡轮廓相交，说明浅度烘焙样品之间相似，与中度、中深度烘焙样品的差异较大。电子鼻可以区分不同烘焙程度的咖啡。如图1C所示，对氮氧化合物敏感的传感器W5S与浅度烘焙的样品呈正相关性。K3与K6咖啡同为中度烘焙；K4与K5咖啡同为中深度烘焙，然而K4与K6咖啡由于甲基类物质的含量相似使二者轮廓有所重叠，同时K3与K5咖啡在硫化物成分含量的影响下轮廓相似。这说明不同种咖啡的调配会影响烘焙程度感观的差异，使中度烘焙的咖啡具有与中深度烘焙类似的感官，反之亦然。

图1 不同咖啡的电子鼻传感器响应值分析Fig.1 Analysis of electronic nose responses to different coffees

2.2 不同咖啡的滋味轮廓分析

利用电子舌快速分析滋味轮廓，如图2A所示。6 种样品的雷达图轮廓类似，只有酸味传感器的响应值为负，说明酸味对咖啡整体滋味的贡献较小。各样品在鲜味与咸味传感器上的响应值差异最大，表明这两种传感器对滋味特征的区分效果最好[20]。为根据滋味特征进一步区分6 种咖啡，对电子舌传感器响应值结果进行PCA（图2B）。6 种咖啡轮廓未重叠，滋味特征明显，易被区分。K3、K5和K6咖啡在PC1的正方向，主要受鲜味、咸味、厚味影响；K1、K2和K4咖啡在PC1的负方向，主要由涩味、酸味、苦味影响（图2C）。每个样品聚类的距离与滋味特征接近度相关，有相同咖啡配比的K1～K4样品，烘焙程度不同，距离较远，说明电子舌可以区分不同烘焙度的咖啡。K5、K6咖啡分别与K1、K3咖啡轮廓接近，说明不同的咖啡配比在一定程度上能够弥补烘焙程度的差异，使不同烘焙度的咖啡具有类似的滋味轮廓。

图2 不同咖啡的电子舌传感器响应值分析Fig.2 Analysis of electronic tongue responses to different coffees

2.3 不同咖啡的挥发性化合物分析

咖啡中各挥发性成分的产生机理相同，即通过美拉德反应、斯特莱克降解和脂质氧化等过程形成，可赋予咖啡不同的香气。6 种咖啡样品的66 种挥发性成分如表1所示。K1～K4咖啡随着烘焙程度增加，挥发性化合物种类增多。这是由于轻度烘焙的热加工时间较短，则各类反应持续的时间较短，所以产生的化合物较少。含硫化合物是咖啡中常见的挥发性组分[21]，电子鼻中对硫化物灵敏的传感器响应值较高，但气质结果中并未检出硫化物，可能是其种类多而各个化合物的含量较低导致。K5、K6咖啡的埃塞尔比亚咖啡豆配比更高，可能是导致其挥发性物质种类较少的原因。K1～K4咖啡的呋喃类物质含量均随烘焙程度的增加呈先上升后下降的趋势，这与Moon[22]和Hashim[23]等研究的结果一致。呋喃类产生于糖类物质的热分解，具有令人愉悦的烘焙香气[24]。烷基吡嗪主要由含羟基的氨基酸，如丝氨酸和苏氨酸受热分解形成[10]，表现为烧烤味和泥土味。二甲基吡嗪被描述为坚果味、可可味，而三甲基吡嗪则带来烘烤味或泥土味。吡嗪类物质随烘焙程度的增加而减少，可能是因为六元环受热断裂加剧，生成烯烃类进一步挥发[25]。为进一步探究挥发性成分的差异，进行PLS-DA，寻找导致组间区别的影响变量[26]。由图3A可知，各样品间轮廓没有重叠，K1～K4咖啡随着烘焙程度的增加，由PC1的负半轴迁移至正半轴；与其产地、混合配比不同的K5与K6咖啡十分接近，但仍不重叠。显然利用GC-MS检测得到的挥发性成分进行不同咖啡的鉴别与区分的效果优于电子鼻。如图3B所示，影响浅度烘焙咖啡香气的化合物有2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2-己酮、2-乙基-1-己醇等。影响中度烘焙咖啡香气的化合物有丙酮、戊酸甲酯、4-吡啶醇等。影响中深度烘焙咖啡香气的化合物有愈创木酚、2,6-二甲基吡嗪、苯甲醛等。聚类热图结果与得分图结果一致。K1咖啡的特异性化合物主要是酮类和酸类，如2-己酮和异戊酸，使其有酸味和醚味。K2咖啡的特异性化合物包括十九烷、4-乙基-5-甲基壬烷等烷烃类。K3咖啡的特异性物质有戊酸甲酯，为其增添水果味。K4咖啡独特的木质香、坚果香及花香分别由酚类、吡嗪类和醇类带来，例如丁香酚、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-1-己醇。

2.4 不同咖啡的代谢小分子分析

如图4A所示，6 种咖啡中共检测出388 种代谢小分子，其中有机酸及其衍生物92 种、核苷及类似物8 种、脂质和类脂分子26 种和生物碱及其衍生物8 种。从中筛选出28 种直接与滋味相关的化合物见图4B。糖类化合物能降低咖啡的苦涩，有助于保留咖啡的挥发性风味组分，增加咖啡的黏度[27]。浅度烘焙的咖啡含有较多的木糖、甘露醇三糖和蜜二糖。麦芽三糖在中度烘焙咖啡中的含量较高。埃塞俄比亚地区豆种配比较云南地区豆种配比更高的混合咖啡样品含有更多的新橙皮糖和蔗糖。氨基酸类物质通过斯特克降解反应生成醛酮类，形成特有的香气和滋味[28]。浅度烘焙的咖啡中呈甜味的丙氨酸、脯氨酸与呈苦味的异亮氨酸、苯丙氨酸的含量较高。赖氨酸在各样品中含量相似。色氨酸、精氨酸与酪氨酸在埃塞俄比亚豆种配比较多的咖啡样品中含量较高。生物碱是咖啡中的主要苦味物质，在埃塞俄比亚咖啡豆配比更高的咖啡中含量更高。中度烘焙的咖啡中肌苷含量较少。

图4 不同咖啡中代谢小分子分析Fig.4 Analysis of small metabolites in different coffees

通过PLS-DA对不同咖啡代谢小分子的关系进行综合分析。由图4C可知，K1、K2是浅度烘焙咖啡，在PC1的负半轴，中度、中深度烘焙咖啡在PC1的正半轴、原点附近，可以明显区分。由图4D可知，L-酪氨酸乙酯、色氨酸-丙氨酸、缬氨酸-天冬酰胺等12 种氨基酸及肽类似物，巴豆酸、戟叶马鞭草苷等5 种脂类，鸟嘌呤、1-甲基腺苷等48 个化合物是引起各样品差异的主要差异代谢物（变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）＞1.5）。区分6 种不同咖啡的烘焙度及产地，可直接选用部分呈滋味化合物，如胞嘧啶核苷、赖氨酸、新橙皮糖等，但更多的是与咖啡的非呈滋味代谢物有关。有研究通过超高效液相色谱串联质谱进行代谢组学分析得到36 种云南小粒咖啡与埃塞俄比亚咖啡的潜在标志物，包括多酚16 种、脂质类8 种、糖类6 种以及少量生物碱类、有机酸类、萜类[29]。

2.5 香味与滋味的相关性分析

为探究咖啡中电子鼻传感器、电子舌传感器与挥发性香气物质、非挥发性滋味物质之间的关系，采用Spearman相关性分析。如图5A所示，明显分为2 组，对短链烷烃、氢化物、苯类、氨类敏感的传感器与厚味、咸味和鲜味传感器存在正相关性，其余传感器与酸味、苦味和涩味传感器呈正相关。不同产地的咖啡本身代谢成分不同，代谢中间产物可能是气味前体成分，所以特征香气成分与代谢成分直接相关。将筛选出的呈滋味代谢物与挥发性香气组分进行相关性分析，如图5B所示，从代谢物角度来看，可以分为3 组，其中一组大多数是呈苦味物质如腺苷、可可碱和肌苷，与乙酰丙酮、2-呋喃甲醇和5-甲基糠醛等呈强烈的正相关。另一组大部分是呈甜味物质如1,4-D-木糖、脯氨酸和丙氨酸，与5-羟甲基糠醛和4-乙基-2-甲氧基苯酚等存在强烈相关性。从挥发性化合物角度来看，与呈滋味代谢物存在强烈相关性的物质大多是呋喃、酚类与吡嗪类。可能原因是加工过程中脂质氧化、美拉德反应等反应并存，且不同阶段对挥发性成分的贡献占比不同，占比大的反应涉及到的物质之间相关性可能会显著[30]。

电子鼻与电子舌作为新兴电子感官分析技术，相对于感官评定员的分析有速度快、检测结果稳定等优点，可以轻松完成原本需要大量实验才能完成的检测[31]。滋味变化与香味变化存在直接相关性，因此电子鼻和电子舌的联用可以在风味解析预测、风味快速检测、真伪鉴别及产地识别等方面应用。

3 结论

本研究全面分析了6 种不同咖啡的风味品质差异。电子感官数据经PC降维可用作咖啡工艺的相似性分类分析。影响浅度、中度、中深度烘焙咖啡的挥发性化合物分别为酚类、吡嗪类和醇类，酮类和酸类，烷烃类和酯类。L-酪氨酸乙酯、缬氨酸-天冬酰胺和巴豆酸等可作为区分不同产地咖啡粉及其混合样本的差异代谢物。浅度烘焙的咖啡含有较多木糖、甘露醇三糖和蜜二糖。麦芽三糖在中度烘焙咖啡中的含量较高。蔗糖、精氨酸等在埃塞俄比亚地区豆种配比更高的咖啡样品中含量更高。5-羟甲基糠醛、愈创木酚、2-呋喃甲醇等特征香气成分与呈滋味的代谢成分如蔗糖、可可碱、L-酪氨酸强烈相关。本研究结果可从香味和滋味角度为咖啡的科学研究提供数据支撑，有助于更好地鉴定识别咖啡种类，为咖啡的工业化生产品质控制提供潜在标志物，为咖啡风味品质标准化评价的建立奠定基础。