基于16 孔5 通道的PCR 仪光路系统研制

苏州雅睿生物技术股份有限公司 徐乐

Q-PCR（实时荧光定量PCR 技术）实现了在体外进行DNA 片段的扩增与定量的结合。本文提出一种基于光纤的荧光光路检测系统，可以实现16 孔5 通道的荧光数据采集，简单介绍了CCD 结构的光路检测方式与PD 结构的光路检测方式，后采用价格更便宜的PD 结构，设计荧光激发驱动光源电路、PD 电路、光路板，基于STM32H743VIT6 处理芯片可控制光源的亮灭，控制电机旋转一周采集PD 光路信号。光路系统对16 孔样品进行光路实验，数据结果表明：PCR 仪光路系统可以检测16 孔，5 通道的荧光数据，空孔荧光波动小于5%，CT 不大于1，CV 不大于1.5%，能满足PCR 光学需求，达到较好的应用效果。

PCR 仪器是一种生物仪器（基因扩增），可以在体外借助多种酶对特定的DNA 片段进行快速的扩增。Q-PCR（实时荧光定量PCR 技术）[1,2]是在PCR 仪器所用的耗材中增加荧光物质，在PCR 工作过程里DNA在不断地扩增，荧光信号也随之增强，通过检测荧光信号，参考标准曲线就可以对DNA 进行定量、定性的分析。

PCR 扩增分为4 个时期，分别为基线期（基线期DNA 进行指数扩增，DNA 数量小及荧光信号较弱）、指数扩增期（指数扩增期DNA 进行指数扩增，DNA 数量及荧光信号进行指数增强）、线性增长（DNA 没有进行指数扩增）以及平台期（DNA 数量稳定）。在指数增长期，荧光扩增产物DNA 分子总数量y=x（1+e）n，x为原始模板DNA 分子数量，公式中的指数n表示PCR 反应的循环数，e表示PCR 扩增的效率（0 ≤e≤1）。由于基线期与指数扩增期具有指数扩增关系，可以进行精确的定量检测，通过PCR 仪器检测样品荧光信号，将阈值线定到指数扩增期，可以实现对DNA 起始模板量的定量检测分析。

1 光学系统原理

实时荧光定量PCR 仪荧光检测系统由激发光系统、检测光系统组成。

CCD 结构的光学系统，采用卤素灯作为激发光源，激发光系统还包括滤光片、光纤。检测光系统是由CCD相机、滤光片、光纤、多元镜组成。卤素灯经过滤光片传到前端光纤，到反应孔，经过光纤孔板上的荧光试剂，再经过后端光纤、滤光片和镜头，最后CCD 相机采集荧光信号（需要调节CCD 定位、设置曝光时间等操作）。检测荧光波长范围由380nm ～780nm，FAM 激发波长470nm±10nm，检测波长520nm±10nm；VIC 激发波长525nm±10nm，检测波长570nm±10nm；ROX 激发波长570nm±10nm，检测波长620nm±10nm；CY5 激发波长630nm±10nm，检测波长670nm±10nm；CY5.5激发波长680nm±10nm，检测波长710nm±10nm。

如图1 所示是PD 结构的光学系统[3]，由激发光系统与检测光系统组成。激发光系统由LED 灯、滤光片、光纤组成，检测光系统由PD、滤光片、光纤、多元镜组成。选择激发波长范围380nm ～780nm 的LED 灯经过滤光片传到前端光纤，到反应孔，经过光纤孔板上的荧光试剂，再经过后端光纤、滤光片和镜头，最后PD 将荧光光学信号转化为模拟信号送入至光路板进行数据转化。

图1 16 孔5 通道PD 架构光学系统Fig.1 16-hole 5-channel PD architecture optical system

如图2 所示是采用PD 类型的光学系统的转盘图。PD 类型的光学系统旋转分为固定盘与转盘。圆盘为旋转盘，内圈为LED 灯通道，外圈为PD 检测通道；上面与步进电机固定的盘为固定盘，外圈16 孔用于检测（与旋转盘外圈相对应），插入光纤通过旋转转盘方式有序扫描光路信号，内圈16 孔插入光纤用于激发（与旋转盘内圈相对应），发射与检测光路孔的配对数及为所能检测的样本孔数，LED 与PD 的配对数及为所能检测样本的通道数，后期可以通过改动旋转盘里LED 与PD 配对数可以扩展通道、变化固定盘孔的个数可以扩展样本孔数。

图2 PD 架构旋转图Fig.2 PD architecture rotation diagram

转盘带有原点复位功能，转盘旋转一圈就是测试一轮光路信号，采用步进电机驱动的方式，16 细分及步进电机走3200 步转盘旋转一圈。将采集到的20 步光学数据通过排序，滤波取最大的四个数做平均得出光强，定位圆盘复位点需注意传感器的触发区域为连续区域，整个区域约25 步(一圈3200 步)，在圆盘设计时，尽量避免孔对准位置在复位区域。

2 光学电路设计

2.1 PD 型光学检测系统原理

如图3 所示为PD 型荧光检测系统图，中位机发送采光指令给光路板，光路板开始开灯、控制电机、转换处理PD 信号，电机回到原点关灯、停止电机运动、停止处理PD 信号、发送数据。

图3 PD 型荧光检测系统图Fig.3 PD fluorescence detection system diagram

2.2 光路板电路设计

光路板采用STM32H743VIT6 主控芯片，包括SWD烧录接口、25MHz 有源晶振、复位电路、EEPROM 采用AT24C128 用于存储数据的功能、运用16 位ADC1，可以采集6 个PD 信号、可控制6 路LED 灯的亮与灭、控制步进电机的PWM 占空比与使能信号、接收原点复位信号、与中位机进行通信功能。

光路板LED 恒流驱动电路，通过PS2801 光耦芯片将单片机数字信号与LED 灯使能信号隔离，弱信号控制LED 灯的亮与灭，单片机信号没有或者信号为高时LED灯不使能，单片机信号为低电平时LED 灯使能点亮。

PD 电路板输出的模拟信号经过ADA4522 运算放大器放大,每路放大比例需根据实际光路进行调整，由于单片机参考电压不能超过4V，运放供电电压大于4V，对运放输出进行了分压，使单片机最大接收电压不超过3V，满足各芯片对电压的需求。

2.3 PD 板设计

选用滨松品牌规格为S6931，滨松生产的PD 批次间较好，还具有响应速度快、灵敏度高、噪声低的优点。光谱响应范围为320nm ～1000nm，暗电流只有20pA，上升时间0.5us。

输出电流IOUT=IDARK+IPD，IDARK为PD 感光电流，IPD为暗电流（噪声）。光电二极管有两种工作模式，分别为光伏、光电导，在光伏模式工作时，二极管无偏置，暗电流可以达到最小；光电导模式工作时，需要施加一个外部反向电压，可以提高响应速度。本文基于对光电二极管的应用速度、暗电流的考虑，选择光电二极管在光伏模式下工作。

3 光学下位机软件设计

光路板单片机上电初始化（开启时钟、ADC1 外设6通道使能，DMA1 将AD 采集数据存储到指定内存、电机复位等），判断是否接收到采光指令，没有收到继续等待，如果收到正确信息启动电机运动、开始采集处理荧光数据、电机运动一圈回到原点或者采光过程中复位超时、电机超3200 步，关闭电机、原点标志复位、处理好光路和状态数据发送给中位机。

4 光路实验

对PD 结构的光学系统进行光路实验，验证光学系统能否工作。进行5 色实验时，光学系统需要借助温度控制模块、中位机（带液晶屏的平板），分别测试5 个通道FAM、VIC、ROX、CY5、CY5.5 的16 孔 位 数 据，如表1 所示。

表1 光学实验数据分析表Tab.1 Analysis table of optical experiment data

测试4 个通道FAM、VIC、ROX、CY5 的A1、A4、B5、B8 孔位数据、测试第五通道CY5.5 的A5、A8、B1、B4 孔位数据。FAM 通道（测试A1、A4、B5、B8 孔位）：3103-6706，扩增效率：2.16；VIC 通道（测试A1、A4、B5、B8 孔位数据：3738-8288，扩增效率：2.22；ROX通道（测试A1、A4、B5、B8 孔位）：1997-9976，扩增效率：5.00；CY5 通道（测试A1、A4、B5、B8 孔位）：2543-8402，扩增效率：3.30；CY5.5 通道（测试A5、A8、B1、B4 孔位）：7821-31534，扩增效率：4.03。

通过表1 的数据，所计算的CT 值小于1，CV 值小于1.5%，光路系统满足PCR 仪器的光路要求。

5 结论

本文阐述了Q-PCR 仪扩增原理，后简单介绍了CCD结构的光路检测方式与PD 结构的光路检测方式，PD 结构由于价格便宜容易操作，提出了基于PD 结构的光路检测系统，采用转盘扫描方式，设计荧光激发驱动光源电路、PD 电路、光路板，可以实现16 孔5 通道的荧光数据采集（可以通过改动转盘升级6 通道）。运用设计的光路系统对16 孔样品进行光路实验，数据结果表明：所设计的光路系统采集荧光信号平稳，可以检测16 孔，5通道的荧光数据，空孔荧光波动小于5%，4 个孔位光路数据，CT 值小于1，CV 值小于1.5%，可以满足实时荧光定量PCR 仪的光学需求[4]。

引用

[1] 钟珂珂.光纤型定量PCR仪荧光检测系统研究[D].杭州.浙江大学,2013.

[2] 毛贺.光纤型定量PCR仪荧光检测光学系统性能研究[J].机电工程技术,2016,45(11):54-56.

[3] 王伟平.96孔实时荧光定量PCR检测系统的开发[D].杭州.浙江工业大学,2011.

[4] 梁子英,刘芳.实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展[J].现代农业科技,2020(6):1-3+8.