番茄类胡萝卜素降解关键基因筛选

程国亭,李同政,闫珑文,常海飞,王延峰,梁 燕

(1 延安大学 陕西省红枣重点实验室,延安大学 生命科学学院,陕西延安 716000;2 延安科育农业科技有限公司,陕西延安 716000;3 西北农林科技大学 园艺学院,陕西杨凌 712100)

番茄是世界第一大蔬菜作物,在国民经济中占据重要地位。番茄作为研究浆果发育和果实品质形成的模式植物,在科学研究中被广泛应用,特别是2012年番茄全基因组测序完成后,番茄各方面研究迅速推进[1]。番茄作为蔬菜和水果兼用的作物,其风味品质受到大家的极大关切。研究发现番茄果实风味主要由葡萄糖、果糖、柠檬酸、苹果酸和29种挥发物组成[2]。番茄果实的挥发物主要是醛类、醇类、酮类、酯类等C4～C16的小分子有机化合物,其前体物质主要是必需营养物质脂肪酸、类胡萝卜素和氨基酸。脂肪酸衍生的C6醇和C6醛含量较高,具有生青气味,与番茄新鲜程度有关。类胡萝卜素衍生的C13和C14酮类、醛类和醇类挥发物,虽然含量较低,但其嗅觉阈值浓度更低,气味特征多为花香、果香、甜味,深受消费者喜爱。苯丙氨酸衍生的挥发物主要是具有刺激性气味的芳香醛和醇,亮氨酸/异亮氨酸衍生的挥发物主要是具有焦糖味的C4化合物以及少量的短链酯。现代栽培番茄风味下降与至少13种主要挥发物浓度降低密切相关[2]。因此,增加类胡萝卜素衍生挥发物的含量可成为番茄风味提升的关键[3]。

番茄类胡萝卜素衍生挥发物主要由类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCDs)裂解类胡萝卜素产生[4-7],只有启动子区含有稀有等位基因的TomLoxC基因才具有裂解类胡萝卜素的功能[8],SlCCDs是裂解类胡萝卜素的关键基因[9-10]。与拟南芥同源性分析发现,番茄SlCCDs基因家族包括7个成员,分别是SlCCD1A、SlCCD1B、SlCCD4A、SlCCD4B、SlCCD7、SlCCD8和SlCCD-like[11-14],SlCCDs基因之间分工和作用机理并不是很清楚。本研究以香气寡淡的TI4001和香气浓郁的CI1005番茄育种自交系为材料,通过分析SlCCDs基因表达与类胡萝卜素及其衍生挥发物含量的相关性,初步筛选出SlCCD1A和SlCCD1B基因是裂解类胡萝卜素产生挥发物的关键基因,可为提升现代栽培番茄果实风味品质奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

研究以风味差异显著的番茄育种自交系TI4001和CI1005为材料,均来自西北农林科技大学番茄生物技术与遗传改良团队。TI4001为绿色普通大果番茄,总挥发物含量最低,不含异戊二烯衍生挥发物,香气寡淡。CI1005为红色樱桃番茄,总挥发物含量最高,尤其是异戊二烯衍生挥发物含量最高,香气浓郁[15]。2022年1月25日在延安市安塞生态农业示范园的育苗工厂播种,3月20日定植在安塞生态农业示范园日光温室,进行田间常规管理。取番茄第三穗花瓣、花萼、根、茎、叶、侧芽、幼果和绿熟期、转色期、粉熟期和成熟期果实[16-17],用于SlCCDs基因表达量测定。同时,绿熟期、转色期、粉熟期和成熟期果实用于类胡萝卜素及其衍生挥发物含量测定。

1.2 试验方法

1.2.1SlCCDs基因特异性表达

在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载SlCCDs基因核苷酸序列。根据实时定量引物设计原则,采用Primer primer 5.0软件设计SlCCDs基因定量检测引物[18](表1),SlActin作为内参基因,采用Trizol法提取番茄总RNA[19]。用Evo M-MLV反转录试剂盒Ⅱ(Accurate Biotechnology Co., Ltd,武汉)先将基因组DNA去除,再反转成cDNA,用NanoDrop核酸浓度测定仪(ThermoFisher Scientific Co., Ltd,美国)检测cDNA浓度,稀释成100 ng/mL。以上述反转录的cDNA为模板,用SYBR®Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒在QuantStudio 5 (Life Technologies Co.,Ltd,美国)上进行qRT-PCR反应。反应体系为20 μL,其中2×SYBR®Green Pro Taq HS Premix 10 μL,cDNA 200 ng,正向和反向引物各0.2 μmol/L,ROX Reference Dye 0.4 μmol/L,用RAase free water补齐至20 μL。反应条件为95 ℃预变性180 s,95 ℃变性10 s,60 ℃复性60 s,变性和复性40个循环[20]。每个样品均设置3个生物学重复,然后根据2-ΔΔCT计算SlCCDs基因的相对表达量。

1.2.2 果实类胡萝卜素和挥发物含量测定

番茄果实4个不同成熟期类胡萝卜素含量用LC-2010A HT高效液相色谱(日本岛津株式会社)检测[21]。用YMC Carotenoid(C30)色谱柱(YMC美国公司,长度×内径为250 mm× 4.6 mm I.D.,填料颗粒径5 μm)对类胡萝卜素进行分离,用番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄素和玉米黄素标准品确定出峰时间,并做线性回归校准曲线[22]。

类胡萝卜素(色谱级)标准品均购买自上海源叶生物科技有限公司。番茄果实4个不同成熟期挥发物定性和定量方法参照[23]。

1.2.3 果实SlCCD1A和SlCCD1B基因克隆

根据Primer primer 5.0软件设计SlCCD1A和SlCCD1B基因CDS全长引物(表1)[24]。采用Trizol法提取果实总RNA,用反转录试剂盒(Takara)生成cDNA[25-26]。PCR扩增SlCCD1A和SlCCD1B基因CDS全长均为1 638 bp。反应体系为50 μL,其中2×高保真酶25 μL,cDNA 400 ng,正向和反向引物各0.5 μmol/L,用RAase free water补齐至50 μL。PCR反应条件:98 ℃预变性58 s,98 ℃变性10 s,58 ℃退火5 s,72 ℃延伸30 s,35个循环,72 ℃终延伸300 s,4 ℃保存[27-31]。用1%琼脂糖凝胶电泳检测,将含有目的条带的凝胶用胶回收试剂盒(天根公司)进行回收,然后送生工有限公司(上海)进行测序[32]。

1.3 数据分析

用Office 2019软件处理数据,用SPSS 22.0软件单因素方差分析中的Duncan(D)检验分析数据之间差异性,用Origin 2019软件作图。

2 结果与分析

2.1 SlCCDs基因表达特性

2.1.1 组织表达特性

番茄7个SlCCDs基因的组织相对表达量如图1所示。SlCCD1A和SlCCD1B在CI1005和TI4001番茄果实中基因表达量显著高于其他组织,SlCCD4A在2个番茄花瓣中表达量显著高于其他组织,SlCCD7和SlCCD8在根中表达量显著高于其他组织。CI1005中,SlCCD4B在侧芽中表达量极显著高于其他组织,在花瓣和绿熟期果实中表达量也较高。SlCCD-like在花瓣中表达量显著高于其他组织。TI4001中,SlCCD4B在转色期果实中表达量显著高于其他组织,SlCCD-like在花萼中表达量高于其他组织。共同点表现为SlCCD1A和SlCCD1B在果实中表达量最高,SlCCD4A在花瓣中表达量最高,SlCCD7和SlCCD8在根中表达量最高。

2个番茄材料SlCCDs基因组织相对表达量不同。CI1005中,SlCCD1A、SlCCD1B、SlCCD4A、SlCCD4B和SlCCD8在各组织表达量均高于TI4001,SlCCD-like表达量在叶、芽和花瓣中显著高于TI4001。TI400中,SlCCD7在根中,SlCCD-like在花萼、幼果和茎中表达量显著高于CI1005。

2.1.2 果实发育时期表达特性

SlCCDs基因表达量在番茄果实发育不同时期有差异(图1)。CI1005中,SlCCD4B在绿熟期果实中最高,SlCCD1B和SlCCD-like在粉熟期最高,SlCCD1A在红熟期最高。TI4001中,SlCCD-like在幼果期最高,SlCCD1A和SlCCD4B在转色期果实中最高,SlCCD1B在红熟期最高。2个番茄材料果实成熟过程中SlCCD4A、SlCCD7和SlCCD8表达量均很低。说明SlCCD4B主要在成熟早期表达,SlCCD1B主要在成熟后期表达,其他SlCCDs表达量几乎不受果实成熟进程的影响。

2个番茄材料SlCCDs基因果实发育期表达不同。CI1005中,SlCCD4B表达量在绿熟期果实中显著高于TI4001番茄,SlCCD1A和SlCCD1B表达量在转色期、粉熟期和红熟期显著高于TI4001。TI4001中,SlCCD4B表达量在转色期果实中显著高于CI1005。其他SlCCDs表达量在2个材料间没有显著性差异。

2.2 果实不同时期类胡萝卜素及其衍生挥发物含量

2.2.1 类胡萝卜素含量

2个材料果实番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄素和玉米黄素含量如图2所示。CI1005中,番茄红素含量远高于其他3种类胡萝卜素。番茄红素含量随着果实成熟显著升高,红熟期高达75.84 mg/(100 g)。β-胡萝卜素含量绿熟期至粉熟期显著升高,粉熟期到红熟期显著降低,粉熟期最高,为8.53 mg/(100 g)。叶黄素在绿熟期未检测到,转色期到红熟期显著降低,转色期最高,为3.89 mg/(100 g)。玉米黄素只在转色期和粉熟期检测到,含量分别只有0.08,0.07 mg/(100 g)。TI4001中,未检测到番茄红素,β-胡萝卜素含量随着果实成熟持续升高,粉熟期最高,为1.18 mg/(100 g)。叶黄素在绿熟期未检测到,转色期、粉熟期和红熟期含量分别为0.76,0.58,0.67 mg/(100 g)。玉米黄素含量绿熟期和转色期高于粉熟期和红熟期,转色期最高,为0.20 mg/(100 g)。说明红色CI1005番茄中类胡萝卜素主要由番茄红素和β-胡萝卜素组成,绿色TI4001番茄中各种类胡萝卜素含量均较低。2个番茄材料类胡萝卜素含量差异显著。CI1005中,番茄红素和β-胡萝卜素含量4个发育时期均显著高于TI4001,叶黄素在转色期和粉熟期显著高于TI4001。TI4001中,只有在转色期玉米黄素显著高于CI1005。2个材料在其他时期类胡萝卜素含量差异均不显著。说明CI1005中类胡萝卜素含量显著高于TI4001。

2.2.2 类胡萝卜素衍生挥发物含量

番茄果实不同发育期类胡萝卜素衍生挥发物如图3所示。CI1005中,类胡萝卜素衍生挥发物含量由高到低依次为6-甲基-5-庚烯-2-酮、香叶基丙酮、柠檬醛和6-甲基-5-庚烯-2-醇,均随着果实成熟持续升高,红熟期最高,分别为179.15,77.54,33.09,6.35 μg/kg。TI4001中,只检测到6-甲基-5-庚烯-2-酮和香叶基丙酮,最高含量只有7.70,3.64 μg/kg,且在果实不同成熟期差异均不显著。说明类胡萝卜素衍生挥发物主要在成熟后期积累。

图3 番茄果实不同成熟期类胡萝卜素衍生挥发物含量

2个材料6-甲基-5-庚烯-2-酮和香叶基丙酮含量在绿熟期差异不显著,在转色期、粉熟期和红熟期,CI1005中6-甲基-5-庚烯-2-酮和香叶基丙酮含量在极显著高于TI4001。说明CI1005中类胡萝卜素衍生挥发物含量显著高于TI4001,且随着果实成熟,差异急剧增大。

2.3 SlCCDs基因与类胡萝卜素及其衍生挥发物之间的相关性

SlCCDs基因表达量与类胡萝卜素(番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄素)、类胡萝卜素衍生挥发物(柠檬醛、6-甲基-5-庚烯-2-醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮和香叶基丙酮)含量之间的相关性如表2所示。

表2 SlCCDs基因与类胡萝卜素及其衍生挥发物之间的相关性

SlCCD1A、SlCCD1B和SlCCD4A与番茄红素、β-胡萝卜素、6-甲基-5-庚烯-2-酮、香叶基丙酮、柠檬醛和6-甲基-5-庚烯-2-醇之间均呈极显著正相关。SlCCD1A和SlCCD1B还与β-胡萝卜素呈极显著正相关,SlCCD-like仅与呈玉米黄素显著正相关,其他SlCCDs基因表达量与类胡萝卜素及其衍生挥发物之间相关性不显著,说明SlCCD1A和SlCCD1B是裂解番茄果实中类胡萝卜素产生挥发物的关键基因。番茄红素和β-胡萝卜素含量与柠檬醛、6-甲基-5-庚烯-2-醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮和香叶基丙酮含量之间均呈极显著正相关,4种类胡萝卜素衍生挥发物含量之间叶呈极显著正相关,说明番茄红素和β-胡萝卜素是这些挥发物的前体。

3 讨 论

前人研究发现,CCDs基因通过多步骤多场所的协同作用裂解类胡萝卜素[33]。在质体中,C40类胡萝卜素先被CCD7和CCD4酶裂解成C27阿朴类胡萝卜素,再被CCD4酶裂解为C13酮和C14二醛挥发物,或者C27阿朴类胡萝卜素进入细胞基质,被CCD1酶裂解为无色C13环己烯酮和黄色C14多烯衍生物[34-36]。本研究表明,SlCCD1A和SlCCD1B基因在番茄果实中表达量显著高于其他组织,随着番茄果实成熟表达量显著升高;类胡萝卜素及其衍生的挥发物积累也表现出同样的趋势,随着番茄果实含量显著增加;SlCCD1A和SlCCD1B基因表达与类胡萝卜素及其衍生挥发物显著正相关,推测SlCCD1A和SlCCD1B基因是番茄果实中裂解类胡萝卜素的关键基因,需要进一步通过过量表达和基因编辑技术进行验证。Simkin等[37]发现,在果实成熟过程中,SlCCD1A表达量绿熟期至橙熟期逐渐降低,橙熟期至红熟期迅速升高,在红熟期达到最高。而SlCCD1B表达量变化趋势与SlCCD1A恰好相反,在橙熟期SlCCD1B表达量最高。Ilg等[38]表明SlCCD1B基因在番茄成熟果实中表达量较高,裂解产物对果实香味贡献最大。Wei等[14]认为SlCCD1A基因在绿熟期表达量最高,破色期迅速降低,粉熟期略有升高,红熟期又开始下降。SlCCD1B与SlCCD1A基因表达变化趋势恰好相反,粉熟期表达量最低,红熟期表达量最高,可能不同番茄材料之间SlCCD1基因表达量变化趋势存在差异,有待进一步验证。

CCD1酶沿着碳主干,在不同位置切割各种立体化学结构的线性、单环和双环类胡萝卜素,产生众多阿朴类胡萝卜素[39-40],如5,6-环氧-3-羟基-β-紫罗酮、香叶基丙酮、β-紫罗酮、C14二醛、3-羟基-β-紫罗酮、9-顺式-新黄质在C9-C10双键裂解产物、9-顺式-新黄质在C9′-C10′双键裂解产物、4,9-二甲基十二烷-4,6,8-三烯二醛、α-紫罗酮、假紫罗酮、3-羟基-α-紫罗酮[38,41-42]。在C9-C10和C9′-C10′双键位置对称降解而生成C13衍生物,如β-紫罗兰酮、环柠檬醛、二氢猕猴桃内酯等降异戊二烯香气物质和C14二醛[43-44]。CCD1也可作用于C5-C6、C7-C8和C11-C12双键[45]。番茄SlCCD1A和SlCCD1B对底物和切割位点没有强的选择性,可多个双键位置氧化裂解顺式类胡萝卜素和全反式类胡萝卜素,以及不同的阿朴类胡萝卜素,产生大量的挥发物、单阿朴类胡萝卜素和二醛产品,包括顺式假紫罗兰酮、橙花醛、香叶醛和法尼基丙酮[37-38]。番茄SlCCD1可在9和10(9′和10′)C-C双键位置对称地切割多个类胡萝卜素,产生的C14二醛和C13环己酮[37]。CCD1还可根据碳C7-C8(7′-8′)和C11-C12(11′-12′)之间的饱和状态以及C5、C9和C13(5′、9′和13′)上的甲基识别其裂解位点[41]。双环类胡萝卜素主要在9,10(9′,10′)双键处被裂解,非环类胡萝卜素在末端断裂形成香叶醛[46]。

反义表达番茄SlCCD1基因,转基因番茄的叶片和果实中的SlCCD1A和SlCCD1B的mRNA水平降低了87%～93%,β-胡萝卜素衍生的C13环己酮——β-紫罗兰酮和番茄红素衍生的C13无环产物——香叶基丙酮含量分别只下降了50%和60%,转基因植株形态和类胡萝卜素含量并无明显变化[47]。对SlCCD1A和SlCCD1B进行敲除的株系显著降低了所有阿朴类胡萝卜素挥发物的浓度,但他们并没有被彻底消除[37],说明阿朴类胡萝卜素挥发物的产生存在转录后调控,或者还与其他酶有关,需要进行进一步研究。