植物bHLH基因家族研究进展及在药用植物中的应用前景

安昌 陆琳 沈梦千 陈盛圳 叶康卓 秦源， 郑平

（1. 福建农林大学海峡联合研究院基因组与生物技术中心，福州 350002；2. 广西大学农学院，南宁 530004；3. 福建农林大学生命科学学院，福州 350002）

外界环境因子如光照、气候、土壤等持续影响着植物的生长和发育，植物通过基因的特异性表达来响应外界环境的变化［1］。转录因子是调控基因表达的级联控制开关，可以在转录水平上调控或影响植物的许多生物过程［2］。药用植物在长期适应各类生长环境的过程中，发生了一系列的基因表达调控和信号转导，逐渐形成了许多独特的生活型。近些年，“中药生态农业” “药用植物拟境栽培”等中药栽培新模式的提出［3-4］，各种药用植物生长发育过程中转录调控的研究不断取得新进展，阐述药用植物适应环境胁迫的策略及其对中药材品质形成的影响，推动中药生态农业学科的进一步发展，是中药现代化研究的新方向和新任务［5］。在药用植物中，影响其活性成分生物合成及转录调控的机制通常是复杂且多层次的。因此，许多转录因子家族成员陆续被人们关注并研究。大量报道证明，MYB、bHLH、AP2/ERF、WRKY和bZIP等转录因子家族在植物生长发育和非生物胁迫条件下发挥重要作用［6］，是调控植物中许多生物过程信号网络的关键组成部分。

在植物中，bHLH是继MYB之后的第二大转录因子家族，具有多种生物学功能，其通过与相关基因启动子区域的顺式作用元件特异性结合，调节靶基因的转录表达，进而调控植物的适应性反应，在调节植物的生长发育、非生物胁迫及代谢网络的响应中发挥作用［7］，是参与药用活性成分合成的重要家族。在中药研究中，道地药材是指产在特定地域，与其他地区所产的同种中药材相比，品质和疗效更好的中药材［8］，不难看出，其原植物是长期适应特定环境的生态型，且次生代谢产物的含量是评价药用植物质量的重要指标，转录调控网络作为环境信号和活性成分合成之间的桥梁，可以很好地解释道地药材的“逆境效应”。因此，深入了解植物bHLHs等转录因子介导的次生代谢产物分子调控网络，对促进药用植物的分子育种、品种改良及农业栽培技术的发展具有重要的指导意义，同时可为道地药材形成机制的探讨提供新思路。

1 植物中的bHLH转录因子

1.1 bHLH转录因子家族的结构特征

转录因子（TFs），也被称为反式作用因子，是一类专门与真核生物基因启动子区域的顺式作用元件结合的蛋白质。它们在转录水平上调节细胞的特定生理或生化过程，因此在生物体的不同发育阶段发挥着重要作用。bHLHs是最大的转录因子家族之一，它们广泛分布于真核生物中。自1989年首次发现bHLH以来，许多bHLH转录因子已在动物、植物和真菌中被发现［9］。bHLH转录因子因其结构特点而被命名，所有的bHLH转录因子都有一个保守的结构域，包含大约50-60个氨基酸（aa），由两个子区域/保守基序组成：一个是碱性DNA结合区（basic DNA binding region, b），另一个是螺旋-环-螺旋区（helix‑loop‑helix region, HLH）。参与DNA结合的碱性区域（b）位于bHLH结构域的N端，长度为10-15个氨基酸不等，能够识别并特异性结合下游靶基因启动子区的调控元件E‑box（5′‑CANNTG‑3′）或 G‑box（5′‑CACGTG‑3′）；HLH结构域位于C端，主要包括两个含有疏水残基的α螺旋和一个长度不等的氨基酸环，该区域由大约40-50个氨基酸残基组成，是与其他转录因子形成同源二聚体或异源二聚体的基本结构（图1）。

图1 黄花蒿bHLH家族成员结构域特征与分布Fig. 1 Domain characteristics and distribution of bHLH family members from A. annua

1.2 bHLH转录因子家族的分类

bHLH转录因子最早在动物中发现，在接下来的深入研究中，根据其组织分布、二聚化能力和DNA结合特性等，将bHLH分为6个组（A-F组）［10］。植物中的bHLH转录因子最早在玉米（Zea mays）中被鉴定［11-12］，同时广泛存在于各类植物中，大多数植物的bHLH与B组的关系更为密切［13］。早在2003年，Toledo‑Ortiz等［14］就将从拟南芥（Arabidopsis thaliana）中鉴定出的147个bHLH转录因子基因划分为21个亚家族。随着分子生物学及生物信息学学科的发展，越来越多不同植物的bHLH转录因子被报道，尤其是非典型性（novelatypical）的bHLH转录因子的鉴定使得该家族成员具有越来越丰富的多样性［15-16］，目前，更多的是基于系统进化关系进行分类，2010年Carretero‑Paulet等［17］对拟南芥、白杨（Populus trichocarpa）、水稻（Oryza sativa）、小立碗藓（Physcomitrella patens）和5种藻类（algae）的全基因组的bHLH转录因子进行了全面的系统发育分析，将鉴定出的638个bHLH基因分为32个亚家族，并且定义了植物bHLH的保守区域，这为将来鉴定新的bHLH转录因子提供了坚实的框架。近年来，得益于基因家族分析的成熟开展，bHLH转录因子家族的报道日益增多，涉及的物种也逐渐广泛，覆盖蕨类、裸子及被子植物中的40余个物种［18］。在不同植物中，所鉴定得到的bHLH转录因子的数目差异明显（图2），如Hong等［19］从红花（Carthamus tinctorius）中鉴定出41个bHLH转录因子家族成员；Shen等［20］从欧洲油菜（Brassica napus）中鉴定出了460个bHLH转录因子家族成员。总之，大量bHLH转录因子家族成员的鉴定为其结构及功能的研究提供了丰富的基础材料。

图2 部分种子植物中bHLH家族成员个数统计Fig. 2 Statistics of the number of bHLH family members in vascular plants

2 bHLH转录因子家族的功能研究

在不同植物中，已经有许多bHLH家族成员的功能被分析，拟南芥中约有30%的bHLH已在不同程度上进行了功能鉴定［21］。家族成员中序列结构虽然具有共同特征，但在植物中发挥的功能作用存在着较大差异，作用于靶基因后所具有的生物学作用也存在较大差异，这使得 bHLH家族成员具有多种生物学功能，并能广泛地参与到植物生命活动中［22］。例如在花生（Arachis hypogaea）中鉴定出61个bHLH参与豆荚的发育及地下部分的特异性生长［23］。在莲（Nelumbo nucifera）中预测了69个NnbHLH的功能，主要与发育生理和胁迫响应有关［24］。在人参（Panax ginseng）中发现至少6个bHLH参与人参皂苷生物合成的调控［25］。以上这些研究为深入了解bHLH转录因子家族在植物中的作用奠定了良好的基础。但应该清楚的是，目前bHLHs的研究更多的是停留在家族成员的鉴定和表达分析上，其中大多数的生理作用和调节功能还有待进一步系统研究。

2.1 调控生长发育

植物生理与转录调控息息相关，bHLHs参与许多生长和发育过程，包括种子萌发、花器官发育及侧根的生长等。果实的发育是由复杂的细胞和分子事件参与完成的［26］。Zhu等［27］报道番茄（Solanum lycopersicum）中的bHLH转录因子SlPRE2可通过调节果皮细胞的分裂，增大果皮厚度进而影响果实大小，是果实发育的调控因子；SlPRE2高表达品系的果实直径略有增加，而功能缺失品系的果实大小略有减小［28］，同时，其在草莓（Fragaria × ananassa）中的同源物FaPRE1可以激活与花托成熟过程相关基因的转录，进而促进草莓的成熟［16］。在甜瓜（Cucumis mleo）中，bHLH倾向于在果实发育早期表达，然而CmbHLH9和CmbHLH114的表达在成熟期至收获期阶段样品中上调，过表达CmbHLH32的转基因甜瓜与野生型相比，果实存在早熟现象［29］。苹果（Malus domestica）中的MdbHLH3直接结合MdcyMDH（苹果细胞质苹果酸脱氢酶）的启动子，激活其转录表达，从而促进苹果酸在苹果果实中的积累［30］；此外，MdbHLH3的过表达增加了苹果叶片的光合能力和碳水化合物水平，通过调节碳水化合物从源（叶片）到库（果实）的分配，也增强了果实中碳水化合物的积累。根是植物的重要器官，高等植物具有形成侧根的能力，以高效地获取水分和养分，而侧根发育的主要来源是位于根系中柱最外层的中柱鞘细胞（pericycle cells）。研究表明，中柱鞘细胞形成后会长时间保持细胞分裂能力，从而使得植物能够响应环境变化灵活地形成侧根，Zhang等［31］揭示了bHLH转录因子介导中柱鞘细胞形成侧根原基的机制，PFA和PFB可以结合成二聚体，进而形成正反馈回路调控邻近木质部极的中柱鞘（xylem pole pericycle）细胞的分裂潜力，在侧根原基的形成中发挥重要作用。另外，SPT是拟南芥中重要的、功能发散的bHLH转录因子，广泛参与一系列植物发育过程［32-34］。在拟南芥中SPT可以限制细胞的增殖和扩张［35］。SPT的突变体可以使主根发育得更长，同时还会出现其他多效性表型，例如更多的花、更短的节间和更长的花期［36］。果实类药材来源于完整的果实或果实的一部分，应用较广。如大枣、山楂等药食同源药材；枸杞、栀子等常用大宗药材。在中药商品流通中，果实类药材的质量主要体现在果实的形状及大小，因此，对其原植物果实生长发育调控机制的研究具有重要意义；另外，药用植物的根作为次生代谢产物主要积累的器官，其大小是根类药材质量评价的重要指标，探究药用植物根系形态建成的机制可为其定向育种提供理论指导。这些报道可为根茎类、果实类药材的研究提供新的视角。

2.2 响应非生物胁迫

近年来，环境问题制约着我国农业的发展，分析药用植物栽培面临的主要胁迫类型，是中药生态农业发展的重要内容。同时，研究药用植物响应胁迫的策略，不仅可以了解药用植物生物学特性，还可以阐明药用植物品质形成的机制，从而为认识和理解药用植物栽培模式提供新思路。

2.2.1 bHLH与植物的抗旱性 干旱是严重限制全球农作物产量和质量的主要环境因素。bHLH响应干旱胁迫，参与提高植物对缺水环境的耐受性。研究发现，bHLH诱导的植物抗旱性增强一般与脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）途径的信号转导以及活性氧（ROS）的清除有关［37］。例如，在保卫细胞中高表达的AtbHLH122可以抑制脱落酸的分解代谢，从而通过增加脱落酸的含量来增强拟南芥的抗旱性［38］。在小麦（Triticum aestivum）中，TabHLH1基因的过表达可以改变植物干旱胁迫下的气孔运动、叶片失水率等生长特征，调节脱落酸途径来提高干旱适应性［39］。在水稻中，OsbHLH148可以作为茉莉酸信号模块的一个组成部分赋予水稻耐旱性，过表达的OsbHLH148可以提高其抗旱性［40-41］。花生中的AhbHLH112与过氧化物酶（POD）基因的启动子直接、特异地结合并激活，从而减少活性氧的积累，同时提高脱落酸水平来增强抗旱性［42］。此外，bHLH还可以通过调节植物生长发育、气孔运动、光合作用和氧化应激等来响应植物的干旱胁迫。例如，苹果中的MdbHLH130在烟草中过表达，可通过调节不同途径提高烟草（Nicotiana tabacum）对水分胁迫的耐受性，包括上调活性氧（ROS）清除相关基因的表达和调节气孔的关闭［43］。另外，一些物种的基因在拟南芥中的异源表达也可以提高拟南芥植株的抗旱性，过表达胡杨（Populus euphratica）中PebHLH35基因的拟南芥可以通过调节气孔密度、气孔开度和蒸腾速率使水分损失减少，同时提高叶绿素含量和光合作用速率来对抗干旱胁迫，且过表达PebHLH35拟南芥植株在水分充足的条件下，主根更长、叶片更多、叶面积更大［44］。密罗木（Myrothamnus fla‑bellifolia）的MfbHLH38基因在拟南芥中的异源表达可以通过调节渗透平衡，增强胁迫诱导的ROS清除系统，提高干旱胁迫下脱落酸的水平，上调与脱落酸生物合成和脱落酸响应相关的基因，从而显著提高拟南芥的耐旱性［45］；刚毛柽柳（Tamarix hispida）中ThbHLH1、枳（Poncirus trifoliata）中PtrbHLH66的研究也得到了类似的结果［46-47］。此外，bHLH家族成员是否通过调控特定基因的表达提高植物的抗旱能力，也是目前的一大研究方向，Liu等［48］研究发现小麦TabHLH49正向调控小麦脱水WZY2的表达，增强小麦的抗旱性；同样Gu等［49］的研究结果表明，干旱可以诱导水稻OsbHLH130的积累，进而激活 OsWIH2的表达，通过参与角质层蜡质的生物合成，降低失水率和活性氧积累，提高水稻的抗旱性。这些结果表明，bHLHs在植物抗旱性中起重要作用，可为作物抗旱性研究提供新的研究方向。

2.2.2 bHLH与植物耐盐性 bHLH转录因子通过影响植物的渗透平衡，来调节植物对盐胁迫的耐受性。植物通常采取两种渗透调节策略来响应高盐环境，一是调节离子的转运；二是合成积累有机小分子物质如脯氨酸、抗坏血酸和黄酮类化合物等。钙被认为是介导盐胁迫信号通路的第二信使，在植物中，第一个被鉴定的与耐盐性有关的bHLH基因AtNIG可以与参与钙离子结合介导盐胁迫信号的响应［50］。AtMYC2和AtbHLH122可以作为上游基因调控Na+/H+逆向转运蛋白基因的表达，进而提高拟南芥的耐盐性［38,51］，其中，AtMYC2还可通过调节脯氨酸的生物合成来实现高盐环境的适应［52］。在水稻中，OrbHLH001在耐盐性方面起着积极的调节作用，过表达OrbHLH001可以激活OsAKT1（弱整流钾离子通道），从而改变盐胁迫下水稻根系的离子通量（Na+/K+），增强对盐胁迫的耐受性。在其他作物中，辣椒CabHLH035通过影响细胞内Na+/K+的比值和脯氨酸的生物合成，在耐盐性中发挥重要作用［53］。葡萄（Vitis vinifera）的VvbHLH1基因在拟南芥中过表达，可以显著增加黄酮类化合物的积累并增强其抗旱性［54］。在玉米中，ZmbHLH55通过直接调节抗坏血酸生物合成相关基因的表达来增加抗坏血酸的积累，从而提高玉米的耐盐性［55］。值得注意的是，研究发现bHLH既可以正向调节又可以负向调节植物对盐胁迫的耐受性［56-57］。SbbHLH85是高粱（Sor‑ghum bicolor）根系发育的关键基因，过表达SbbHLH85可以激活ABA和生长素信号通路导致根毛数量和长度显著增加，增加Na+的吸收；酵母双杂交和BiFC实验均证实SbbHLH85可以和SbPHF1（磷酸盐转运蛋白1）相互作用，破坏盐胁迫下植物体内磷的运输和积累，加剧了高盐引起磷的不均匀分布，大大降低高粱的耐盐性［58］。目前，土壤盐渍化已成为全球性问题，我国盐土面积大、范围广，培育耐盐性高的作物品种在盐碱土壤上的种植，既可以充分利用土地资源，改善土壤的生态环境，又可增加作物的总产量。

2.2.3 bHLH转录因子与植物低温逆境 低温胁迫是目前农业生产领域最重要的灾害之一，持续的低温会损害植物组织结构和生理功能，对农业生产造成巨大影响。bHLH转录因子可以通过ICE‑CBF‑COR途径在植物应对低温逆境中发挥作用。Chinnusamy等［59］从拟南芥中成功分离出bHLH转录因子ICE1，与CBF3基因启动子序列中的MYC识别位点结合，在拟南芥中过表达ICE1能够增加CBF3基因表达，提高植株对低温胁迫的耐受性。在拟南芥中过表达山葡萄（Vitis amurensis）的两个bHLH基因VaICE1和VaICE2，可显著诱导下游冷响应基因CBF1、COR15A和COR47的表达，增强拟南芥的耐寒性［60］。IbbHLH79是一个在番薯（Ipomoea batatas）中高效表达的ICE1样基因，可以激活CBF途径；且过表达IbbHLH79的转基因植株表现出更强的耐冷性［61］。同样，在水稻中过量表达AtICE1可上调CBF/DREB途径相关基因的表达，增强转基因植株对低温胁迫的耐受性［62］。苹果中鉴定出的MdCIbHLH1，烟草中发现的NtbHLH123，均能上调CBF2基因的表达，进而增加植物的耐旱性。在其他植物中，同样存在许多受低温逆境特异性诱导的bHLH，如水稻中的OsbHLH1，苦荞麦（Fagopyrum tataricum）中的FtbHLH2等［63］。Yang等［64］以龙眼（Dimocarpus longan）为材料，研究了CBF基因诱导子DlICE1的转基因表达，其在拟南芥中的过表达可增加幼苗中的脯氨酸含量，降低丙二醛含量，从而提高拟南芥的耐冷性，此外，低温下MdbHLH3通过增加花青素的积累来提高苹果的耐寒性［30］。在中药农业中，许多南方的特色药材因山地丘陵等地理环境，很难开展大批量种植，这限制了中药种植产业的发展，突破原有农业气候划区的限制，适当将种植带北移可以扩大药材产量，但需要克服持续的低温胁迫。在植物适应低温胁迫的过程中，其体内发生了一系列分子水平的反应，这些反应按照有序的时空顺序发生，相互联系，形成了一整套低温应答的分子机制。了解植物低温应答的分子机制可为药用植物往北种植拓展奠定基础。

2.3 参与重金属的平衡与稳态

重金属残留会严重制约作物的生长和生产力［65］，现今环境污染日益加剧，研究植物对重金属的生理响应和代谢的分子机制尤其重要。近年来，不断有研究证明bHLH广泛参与铁稳态，在拟南芥中铁吸收主要受到bHLH 转录因子FIT的调控，且至少涉及16个bHLH转录因子，它们通过形成错综复杂的调控网络紧密参与到铁稳态的调节［66-67］，例如bHLH转录因子ILR3和PYE可以在铁胁迫下帮助植物细胞形成光保护作用，并改变叶绿体形态，阻止有害的活性氧（ROS）生成，加快光系统II的修复［68］。不同植物的不同bHLH成员在缺铁调控中发挥不同的作用。如菊花（Chrysanth‑emum morifolium）中CmbHLH1通过H+‑ATP酶介导的根际酸化促进铁的吸收。在缺铁条件下，NtbHLH1的过表达会导致根系变长、根际pH值改变，并增加铁酰化还原酶活性，进而激活缺铁反应基因的表达［69］。研究表明，GmbHLH57和GmbHLH300的过表达上调了参与铁吸收相关基因的表达，并增加了转基因大豆（Glycine max）植株的铁含量［70］。铁相关的bHLH转录因子IRO2已被确定为水稻铁吸收的关键调节因子。研究发现OsbHLH156可与IRO2形成协同互作模式，在铁稳态中的发挥作用［71］。Wang等［72］报道指出057在侧根中高表达，并参与维持铁的动态平衡。进一步研究发现，OsbHLH061可通过与OsPRI1相互作用并招募转录抑制辅助因子OsTPL/TPRs来抑制关键下游基因OsIRO2和OsIRO3的转录，从而抑制铁在水稻地上部的积累［73］。镉（Cd）是一种广泛存在于环境中的重金属，在Cd胁迫下bHLH转录因子基因（FIT、 AtbHLH38和AtbHLH39）会协同MSR3的表达，参与提高拟南芥对Cd的耐受性［74］。大豆GmORG3 可以通过增加光合作用系统的稳定性来降低Cd胁迫对转基因烟草植株的伤害，并增加叶片叶绿素含量［75］。宋倩［76］发现，GmbHLH30在烟草中的过度表达，可以通过维持渗透压来增强其铝耐受性。在酸性土壤中，锰毒性也是限制作物产量的一个重要因素，研究发现ZmbHLH105可能通过调节抗氧化机制，来调节植物体内ROS清除和Mn/Fe相关转运蛋白的表达，提高玉米对锰胁迫的耐受性［77］。近年来，国内外中药材市场需求旺盛，许多药用植物开始像水稻、果蔬等作物一样，进行农业化人工种植。现阶段，农残、重金属超标等问题已严重影响了中药材安全性，成为制约中医药产业发展的重大瓶颈。进一步阐明植物对重金属等胁迫的响应机制及调控网络，定向选育高耐受性、强代谢性的优质药用植物品种，有助于进一步提高中药产业的整体发展质量与效益。

2.4 参与次生代谢产物的生物合成

除了在生长发育中发挥作用外，植物通过产生广泛的具有生物活性的专门代谢物来应对压力。bHLH还在植物次生代谢产物的生物合成过程中发挥重要作用，包括黄酮类、萜类、生物碱类、酚酸类等的生物合成［78］。花青素属于黄酮类化合物，是作物果蔬的主要呈色物质，同时也是保健活性物质。以拟南芥为例，研究证明AtTT8（Transparent Testa突变）是植物体内花青素合成的关键酶基因［79］，其表达调控是黄酮类相关基因表达特异性激活的重要调控步骤，可以诱导花青素的合成［80］。在莲和细茎石斛（Dendrobium candidum）中的同源基因也表现出诱导活性［81-82］。在牡丹（Paeonia ×suffruticosa）中，花青素的生物合成受PsbHLH1正向调控，PsbHLH1可直接与二氢黄酮醇4‑还原酶（PsDFR）和花青素合成酶（PsANS）基因的启动子结合，转录激活它们的表达［83］，这为牡丹新品种的分子育种奠定了坚实基础。在桑（Morus alba）中，MabHLH3是调控果实颜色形成的关键基因，其异常表达可破坏花青素调控网络的平衡，打乱桑树果实的色素组成［84］。bHLH对下游基因除了多被表征的激活现象，还存在阻遏现象，蜡梅（Chimonanthus praecox）中CpbHLH1基因抑制拟南芥中花青素的积累［85］；丹参（Salvia miltiorrhiza）中SmbHLH92在其根和韧皮部中高表达，在SmbHLH92‑RNAi转基因株系的毛状根中，丹参酚酸和丹参酮的含量显著增加，表明SmbHLH92是参与调节丹参酚酸和丹参酮生物合成的负调控因子［86］，而SmbHLH10可以直接与丹参酮途径基因启动子中的G‑box结合，激活其表达，进而上调丹参酮的生物合成［87］。此外，在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中鉴定出2个JA诱导的bHLH基因TSAR1和TSAR2，可以通过不同的激活模式激活MVA途径的相关基因，导致三萜皂苷含量增加［88］。bHLH还调控植物中生物碱类成分的生物合成［89］，在日本黄连（Coptis japonica）中，CjbHLH1在体内与IQA生物合成基因的启动子序列直接相互作用，激活相应的通路，进而导致生物碱类成分的特异性积累；研究还发现，CjbHLH1的同源物只在产生IQA的植物物种中发现，这对药用植物的研究具有重要参考价值。另有研究表明，PlbHLH79/148/149是最有可能参与粉葛（Pueraria montana var. thomsonii）中葛根素生物合成途径的候选基因［90］；杏仁（Prunus domestica）中PdbHLH2参与了苦杏仁苷的生物合成［91］。植物的次生代谢在植物适应环境、生物间信息交流以及协同进化过程中发挥重要作用，药用植物在遭受胁迫后各项生理生化指标发生的变化以及次生代谢产物的积累，是评价药用植物品质的重要依据。进一步研究bHLH的功能，对于系统阐释药用植物有效成分的积累、道地药材的成因，以及药用植物资源合理开发利用等具有重要意义。

3 bHLH转录因子在药用植物中的研究

药用植物中的高价值活性成分因其对人类健康的益处而受到研究关注，例如抗疟疾的青蒿素、抗心血管疾病的丹参酮等［92］。目前，有关bHLH转录因子的研究还集中在各类重要作物上，对于药用植物的研究仍涉及较少。我国是药用植物资源丰富的国家之一，对药用植物的栽培、采收和加工有着悠久历史。随着基因组学和现代生物技术的发展，药用植物的功能基因组学研究与应用变得极为重要。因此，本文对两种常见且重要药用植物中的bHLH转录因子的研究进展进行总结，为药用植物功能基因资源更深层次的开发和利用提供参考，对于药用植物合成生物学及细胞工厂的应用研究有着重要的意义。

3.1 丹参

丹参是较早发布全基因组的药用植物，为其生命科学研究提供了系统的工具，以丹参作为药用模式植物而开展的分子生物学研究、组学研究和代谢工程研究逐步深入。Zhang等［93］对丹参bHLH基因家族进行了全基因组分析，共鉴定出127个ApbHLH基因，根据它们在染色体上的物理位置和重叠群数量进行了重新命名；通过系统发育分析，将它们划分为25个亚家族；根据MeJA处理后的基因特异性表达模式和上调表达模式，揭示了7个bHLH基因可能参与丹参酮生物合成的调节；其中，SmbHLH37、SmbHLH74和SmbHLH92的基因表达与丹参酮生物合成及积累模式的规律一致，研究结果为进一步了解丹参bHLH转录因子的分子基础和调控机制奠定了基础。李林［94］从丹参中鉴定出一个参与丹酚酸和丹参酮调控的转录因子SmbHLH59。多序列比对和系统发育树分析显示，SmbHLH59属于IIIe亚家族成员，该家族的成员包括MYC2、MYC3、MYC4和MYC5，它们协同调控JA介导的植物次生代谢产物的积累；表达模式分析表明，SmbHLH59在丹参叶中高表达，而且受到MeJA的诱导，说明SmbHLH59可能与JA信号和丹酚酸合成相关。随后实验证明SmbHLH59通过结合E/G‑box元件激活丹酚酸和丹参酮合成途径上关键酶基因的启动子，促进丹参酮和丹参酚酸的积累，初步阐释了SmbHLH59的分子机制。在拟南芥中，JA诱导的转录调控主要受到转录因子MYC2的影响［95］，Liu等［96］在丹参中鉴定并表征了由MeJA最为显著负调控的新型bHLH转录因子SmbHLH60，并且SmbHLH60过表达毛状根中的酚酸和花青素含量显著降低，而通过CRISPR/Cas9敲除SmbHLH60则导致毛状根中酚酸和花青素含量的显著升高；另外，SmbHLH60的表达与酚酸和花青素浓度呈负相关，同时，参与花青素和酚酸合成的关键基因在SmbHLH60敲除系中上调，而在SmbHLH60过表达株系中下调。在此基础上，该研究进一步解析了SmbHLH60 调节丹参中次级代谢过程的分子机制。结果显示，SmbHLH60可以直接结合SmTAT1和SmDFR等靶基因的启动子抑制它们的表达并导致丹参中酚酸和花青素生物合成的显著减少。此外，研究还揭示了SmbHLH60可以和 SmMYC2形成异二聚体，以拮抗的方式调节酚酸和花青素的生物合成。方庆［97］以过表达 SmbHLH124的丹参毛状根为材料，结合高效液相色谱技术与转录组测序技术发现，过表达SmbHLH124根系中的4种丹参酮类化合物的含量显著增加，而丹参酚酸类化合物含量减少，初步解析了bHLH124参与了丹参次生代谢产物生物合成的调控机制。综上所述，丹参中bHLH转录因子的研究取得了一定的进展，但还需继续深入。

3.2 黄花蒿

黄花蒿（Artemisia annua）是一线抗疟药物青蒿素的唯一天然来源，随着青蒿素及其衍生物不断扩大抗疟以外的适应症范围，黄花蒿的市场需求日趋增加，高青蒿素含量黄花蒿新品种的选育是目前相关研究的重点方向。甘雨等［98］基于黄花蒿全基因组及转录组数据，共鉴定出99个黄花蒿AabHLH基因，通过系统发育分析将其分为13个亚族；同时进行AabHLH基因家族成员在不同光处理下的基因表达分析发现，AabHLH基因在不同水平上响应蓝光、红光、远红光、白光调控；根据表达量推测其中6个亚族基因为光照条件下青蒿素合成途径调控基因，7个亚族基因为非光照条件下青蒿素合成途径调控基因，为深入了解AabHLH基因功能及其在不同光环境下青蒿素生物合成调控机制提供参考。黄花蒿中的amorpha ‑4,11‑diene合成酶（ADS）和CYP450单加氧酶（CYP71AV1）是参与青蒿素生物合成的两种关键酶［99-100］，他们的启动子均含有E‑box原件，是bHLH转录因子的结合位点［101-102］。青蒿素主要在青蒿叶片表面的分泌型腺毛中合成和积累［103］，Ji等［104］从青蒿的腺毛的cDNA文库中鉴定并克隆了一个bHLH转录因子bHLH1，通过生化分析发现bHLH1可以通过与ADS和CYP71AV1等青蒿素生物合成相关基因启动子中的E‑box结合来正向调控这些基因的转录水平，此外，bHLH1在青蒿叶片中的瞬时表达可增加青蒿素生物合成相关基因如ADS、CYP71AV1和HMGR的转录水平，进一步的胁迫实验发现细胞外ABA处理可以诱导AabHLH1的表达，从而激活ABA信号通道提高其对胁迫的耐受性。这些结果表明，AabHLH1对青蒿素的生物合成具有正向调节作用。Zhang等［105］鉴定了一个在花蕾和腺体分泌毛中高表达的bHLH成员，命名为AaPIF3，能够显著增强青蒿素生物合成基因的启动子活性，包括ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1，正向调控青蒿素的生物合成。并且通过AaPIF3的高表达，已成功培育出青蒿素高产的转基因植株。Xiang等［106］通过系统进化分析发现，AabHLH112与拟南芥冰结合蛋白（IBP）聚为一类，IBPs可能通过限制质外体中冰晶的生长来帮助防止与冷冻相关的损伤［107］。抗冷胁迫研究中发现，AabHLH112过表达显著上调了AaERF1和青蒿素生物合成基因的表达水平，从而促进了青蒿素的合成。Shen等［108］通过基因共表达分析和系统发育分析鉴定了与青蒿素生物合成相关的两个MYC型转录因子AabHLH2和AabHLH3，并且它们的表达模式与青蒿素合成途径基因相关；进一步的实验发现两者过表达株系的青蒿素积累显著降低，而RNAi株系的青蒿素含量显著升高，表明AabHLH2和AabHLH3作为转录抑制因子负调控青蒿素生物合成，揭示了一个新的青蒿素生物合成调控网络，为植物次级代谢的转录调控提供了新见解，并为青蒿素生产的代谢工程提供了新的靶基因。在青蒿中，除青蒿素外还含有丰富的其他萜类化合物，倍半萜是其萜类化合物的主要成分之一。周琪［109］采用分子生物学、生物化学和生物技术等多学科综合手段对腺毛中高表达的AabHLH106基因进行研究发现，AabHLH106在青蒿中能够激活AaBFS、AaCPS和AaECS的表达，从而促进 β-法尼烯、β-石竹烯和雪松醇的生物合成，在倍半萜生物合成中起到正向调控作用；此外，AabHLH106还能够响应ABA诱导，推测其可能在植物逆境胁迫方面也发挥重要作用。

4 总结与展望

本文总结了各植物物种中关于bHLH的最新研究进展，并展示了一个相对全面的bHLH转录因子家族研究概况（图3）。目前，bHLH转录因子在结构和功能方面的研究已取得重大突破，通过获得bHLH转录因子基因的过表达植株或RNAi缺失体，对植株进行生理生化研究，能够进一步明确bHLH转录因子的功能。因此利用基因工程的方法研究bHLH转录因子家族功能，阐明bHLH协调多种内外环境来调控植物生理的机制，改良植物的胁迫抗性从而为植物抗逆育种服务将是未来bHLH转录因子家族相关研究的一个主要方向。由于bHLH转录因子功能丰富、作用机制较为复杂，进一步全面、深入地阐明bHLH转录因子家族功能及其作用机制，仍是一个重要课题。

图3 bHLH家族成员参与植物生长发育和非生物胁迫过程的预测模型Fig. 3 A predictive model for the involvement of bHLH family members in the growth and development of plants and abiotic stress processes

bHLH转录因子家族成员众多，结构功能多样，但是目前对其功能的大部分研究仅在拟南芥、烟草、水稻等模式植物中展开，具有一定的局限性。bHLH在高等植物中广泛存在，并且随着物种的分化进化出具有不同生化特性的功能；另外，根据蛋白序列的同源性，bHLH家族已被分类，相同的亚家族通常具有相似的序列结构，以及更相似、保守的功能［110］。药用植物种类繁多，具有复杂的生境、丰富的生活型，是进一步完善其起源进化多样性及功能研究的可靠材料，同时，bHLH基因功能的精确定义可以进一步为药用植物的栽培提供指导。近年来，各类药用植物全基因组图谱的完成，为全面、系统地分析转录因子分布和基因准确功能的鉴定奠定坚实基础。

在许多转录因子基因家族中，蛋白质需要与同一家族或另一个家族中的另一个分子发生物理相互作用，以形成功能性二聚体并结合DNA，从而行使特定的功能［111-112］。根据合作伙伴的选择和细胞环境，每个二聚体都会触发一系列调节事件，从而出现更高阶的调控网络。在植物中，有许多实例证明bHLH转录因子家族能够与自身结合形成同源二聚体，也能够与其他转录因子结合形成异源二聚体、三聚体发挥作用，每个独特的bHLH二聚体都会触发一系列调节事件，从而导致特定的细胞命运，这赋予了bHLH多样的生化特性以及广泛参与植物生理活动的能力。因此，仅对单个bHLH转录因子的功能研究能获取的信息十分有限，进一步研究bHLH二聚化的特异性，结合后的交互特性以及功能产物，对于理解植物转录翻译的复杂性以及新一代育种策略都至关重要。

植物对环境胁迫的适应受分子网络级联控制。它们激活应激反应机制以重新建立内稳态，保护和修复受损的蛋白质和膜，在这过程中bHLH转录因子家族起着极其关键的作用，改良植物对各种胁迫的抗性从而为植物抗逆育种服务将是未来关于bHLH转录因子家族研究的一个主要方向。但是，与植物响应生物胁迫主要依赖于单基因性状不同，植物对非生物胁迫的抗性是复杂的多基因控制的数量性状，因此更难控制和工程设计。一般转入单个抗逆基因对植株的抗逆性提高幅度有限，甚至不能提高抗逆性，因此应加速多基因（尤其是调节基因）共同导入植物的系统研究，才有可能全面阐明植物的抗逆调控网络。事实上，各类胁迫存在一定的相似之处。例如，无论是在盐胁迫还是干旱胁迫下，植物都会产生缺水胁迫，合成高水平的ABA，另外，活性氧（ROS）是在各种环境胁迫下产生的一种重要而常见的信使，它们结合下游靶点激活特定的反应，另外，游离脯氨酸的积累也是植物应对各类胁迫的主要手段［113］。在农业生产中，对作物的危害往往是几种胁迫的同时发生［114］，对不同胁迫组合的耐受性是一个较为复杂的生理特征，涉及多种途径以及不同信号转导途径之间的串扰，在药用植物的种植加工中亦是如此。因此，加强多种胁迫模式的探索，才能为农业生产提供更切实的指导。

药用植物发挥功效、防病治病的基础是在植物体内积累的具有生物活性的次生代谢产物，这些药用活性成分都贮存在它们的药用部分（根、茎、树皮、叶、花、果实或种子等）内。因此，研究药用植物的结构发育与生理功能、次生代谢产物的合成和积累，具有重要的理论和实践意义。研究发现，bHLH基因家族成员中只有部分基因在同一基因型、植物器官或发育阶段中表达，并且它们的表达谱在不同的基因类型、组织或发育阶段之间存在着倍数的差异［115］。这些表达特异性可能反映了它们的功能分化。在药用植物中，应该更着重于药用部位高表达bHLH基因功能的挖掘，解析与次生代谢产物合成相关的分子机制和关键的信号通路，进一步为药用植物的高效定向育种提供新思路与新方法。