温肺化纤颗粒通过调节铁死亡改善肺纤维化的机制研究

黎强 朱国双 （江西中医药大学 南昌 330004）

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是一种慢性、进行性的，并对肺组织具有较强破坏性的纤维化性间质性肺病，临床上主要表现为进行性呼吸困难并伴有肺功能下降［1］。病理学上肺纤维化主要表现为上皮细胞持续受损，成纤维细胞激活并分化为肌成纤维细胞，从而导致细胞外基质在肺组织内异常沉积，最终导致肺组织形成纤维性闭塞甚至“蜂窝状”肺［2］。临床上以特发性肺纤维化最为常见，且治疗效果最差，平均生存周期为2.5～3.5 年［3］。目前临床治疗均不能延缓肺纤维化患者的疾病进展，因而亟需新的治疗思路和方法进行防治。

细胞死亡有多种方式，铁死亡是一种区别于细胞坏死、自噬及凋亡的新型细胞死亡方式［4］。通过对细胞线粒体基因库的分析，发现铁死亡由一个独特的遗传网络所调控，敲除该调控网络中的关键基因可以抑制细胞铁死亡，但对细胞坏死、自噬及凋亡无明显影响［5］。铁死亡的发生，主要是由于铁质的大量堆积，导致抗氧化系统失衡，出现活性氧（ROS）和脂质过氧化物的累积，进而诱导机体损伤的发生。

温肺化纤颗粒是导师刘良徛教授在传承国医大师洪广祥教授“治肺不远温”的学术思想指导下所创立，现已开发为江西中医药大学附属医院院内制剂。温肺化纤颗粒以治疗“阴疽”的“阳和汤”为基础方，并予以虫类药物以达“搜剔窜透”之功。在前期研究中，课题组已证实温肺化纤颗粒具有抗氧化作用，并能改善博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺脏损伤［6-8］。本研究将观察温肺化纤颗粒是否通过抑制铁死亡达到改善肺纤维化的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性KM 小鼠50 只，体质量（27.5±2.5）g，5～6 周龄，购自江西中医药大学实验动物科技中心，生产许可证号：SCXK（赣）2018-0003。饲养于江西中医药大学中医学院实验中心，所有小鼠均可自由饮水进食。本研究通过江西中医药大学实验动物伦理委员会审查批准，批件号：JZLLSC20210031。

1.2 药物和试剂

博来霉素（浙江瀚晖制药有限公司，批号：20067411），购于南昌大学第一附属医院高新医院，使用时溶于0.9%生理盐水中，浓度为5 mg/kg。温肺化纤颗粒（江中制药股份有限公司，批号：20030003），组成：熟地黄15 g，鹿角霜15 g，炮姜炭9 g，肉桂4 g，麻黄10 g，炙甘草10 g，白芥子10 g，土鳖虫8 g，桃仁8 g，红花10 g，川芎10 g，地龙10 g，规格为15 g/袋，购于江西中医药大学附属医院，使用时溶于0.9%生理盐水中，浓度分别为0.292 5、0.585、1.17 g/mL。一抗NRF2 Rabbit mAb、NQO1 Rabbit mAb、Heme Oxygenase 1（HO-1/HMOX1）Rabbit mAb，二抗HRP Goat Anti-Rabbit IgG（H+L），购于武汉爱博泰克（ABclone）生物科技有限公司。MDA、GSH、Fe 比色法测试盒，购于武汉赛维尔生物科技股份有限公司。

1.3 造模、分组及给药

采用随机数字表法将50 只小鼠分为对照组、模型组和温肺化纤颗粒低剂量（WFHXL）、中剂量（WFHXM）、高剂量（WFHXH）组，造模前对各组小鼠进行禁食禁水12 h，配制4%水合氯醛（0.1 mL/10 g）对各组小鼠进行腹腔注射麻醉，根据小鼠体重，进行气管内一次性滴入博来霉素5 mg/kg 建立肺纤维化模型，对照组小鼠气管内给予等量的生理盐水。造模后温肺化纤颗粒灌胃剂量经人与小鼠体表面积比值折算，中剂量为人与小鼠的等效剂量5.85 g/kg，低剂量为2.925 g/kg，高剂量为11.7 g/kg，每日1 次，给予药物体积为0.1 mL/10 g 灌胃。模型组和对照组给予生理盐水0.1 mL/10 g 灌胃，各组均连续灌胃28 d，期间小鼠可自由进食、进水。

1.4 指标检测

末次给药24 h 后，腹腔注射4% 水合氯醛（0.1 mL/10 g）麻醉后处死小鼠，取各组小鼠左肺上叶固定于4%多聚甲醛中48 h，以备包埋切片，用于相关病理染色；余肺组织于-80 ℃冰箱保存。

1.4.1 病理染色 HE 染色：固定完成的肺脏组织进行不同浓度乙醇梯度脱水、二甲苯透明，浸蜡2 h后，进行石蜡包埋切片，并脱蜡至水，放入苏木素中浸泡，自来水洗，然后再进行1%盐酸酒精分化，5 s 后，快速放入自来水中冲洗，然后进行不同浓度乙醇梯度脱水，二甲苯透明，以及中性树脂封片，最后显微镜下镜检，并进行图像采集分析。

Masson 染色：取小鼠肺脏石蜡块，常规脱蜡、乙醇梯度脱水，按照Masson 染色试剂盒说明书，不同浓度乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，最后于显微镜下观察拍照。

1.4.2 Real-time PCR 检测 -80 ℃冰箱中取出小鼠肺脏组织，称取20 mg 组织，进行提取RNA，并测定RNA 浓度。测定完成后，依据逆转录说明书进行操作，完成逆转录，并进行扩增，共40 个循环。按2-ΔΔCt 法进行定量分析，此次实验所需引物均由武汉赛维尔生物科技有限公司进行合成，β-actin 为内参。见表1。

表1 肺组织Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA引物序列

1.4.3 ELISA 检测 4 ℃冰箱中取出GSH、Fe、MDA 试剂盒，室温静置20 min；-80 ℃冰箱中取出小鼠肺脏组织；设定测定孔、标准品孔和空白孔，每孔设定3 次重复。根据组织称取重量，按重量（g）∶体积（mL）=1∶9 的比例，制备10%匀浆液。在低温高速离心机下，4 ℃ 1 500 r/min 离心10 min，收集上清液。采用比色法检测上清液中的Fe 含量，并参照GSH、MDA 试剂盒制备标准曲线，得出相应的GSH、Fe、MDA 数值。

1.4.4 免疫组化法检测 取小鼠肺脏石蜡块，进行常规切片、脱蜡，3%过氧化氢室温清除过氧化物酶活性，纯水冲洗3 次；然后将切片放入固定容器内，加入PBS，置于高温烤箱中，进行高温抗原修复，室温15 min，5%山羊血清封闭，静置15 min，甩去血清，加入一抗稀释液，4℃过夜，进行室温复温，而后PBS 冲洗3 次，每次5 min。滴加二抗稀释液，37 ℃恒温箱静置30 min，PBS 冲洗3 次，每次5 min。最后进行DAB 显色，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜拍照，Image J 1.44图片分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件进行统计分析。所得数据以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐采用LSD 法，方差不齐采用Dunnett T3 检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠病理染色结果

HE 和Masson 染色提示，对照组小鼠肺脏病理结构清晰完整，肺泡间隔未见增生，未见蓝色胶原纤维的沉积。与对照组比较，模型组小鼠肺脏病理结构出现明显破损，肺泡间隔明显增厚，炎性细胞浸润以及纤维组织明显增生，同时伴有明显的蓝色胶原纤维沉积。与模型组比较，温肺化纤颗粒各组小鼠肺泡间隔稍增厚，肺泡间隔破损稍轻，纤维组织增生和炎性细胞浸润减少，同时温肺化纤颗粒各组小鼠肺脏蓝色胶原纤维明显减少，其中WFHXL组蓝色胶原纤维含量最多，其次为WFHXH 组，而WFHXM 组胶原纤维含量最少。见图1。

图1 各组小鼠肺脏病理染色（HE和Masson染色，×200）

2.2 各组小鼠肺脏组织中GSH、MDA、Fe 含量检测结果

与对照组比较，模型组小鼠肺脏组织中MDA和Fe 含量明显升高（P＜0.01），GSH 含量明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，温肺化纤颗粒低、中、高剂量组小鼠肺脏组织中MDA 和Fe 含量明显降低（P＜0.01），GSH 含量明显升高（P＜0.01）；与WFHXL 组比较，WFHXM 组和WFHXH 组小鼠肺脏组织中MDA 和Fe 含量明显降低（P＜0.01），GSH 含量明显升高（P＜0.01）；且WFHXM 组治疗效果要优于WFHXH 组（P＜0.01）。见表2。

表2 温肺化纤颗粒对小鼠肺脏组织GSH、MDA、Fe含量结果（，n=3）

表2 温肺化纤颗粒对小鼠肺脏组织GSH、MDA、Fe含量结果（，n=3）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与WFHXL剂量组比较，▼P＜0.01；与WFHXH量组比较，▲P＜0.01。

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2.3 各组小鼠肺脏Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA表达结果

与对照组比较，模型组小鼠肺脏组织中Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，温肺化纤颗粒低、中、高剂量组小鼠肺脏组织中Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.01)；与WFHXL 组比较，WFHXM 组和WFHXH 组小鼠肺脏组织中Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA 水平明显升高（P＜0.01），且WFHXM 组优于WFHXH 组（P＜0.01）。见图2。

图2 各组小鼠Real-time PCR检测结果

2.4 各组小鼠肺脏免疫组化结果

与对照组比较，模型组小鼠肺脏组织中Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表达水平明显减少；与模型组比较，温肺化纤颗粒低、中、高剂量组小鼠肺脏组织中Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表达水平明显升高；与WFHXL 组比较，WFHXM 组和WFHXH 组小鼠肺脏组织中Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白水平明显升高，且WFHXH 组低于WFHXM 组。见图3。

图3 各组小鼠肺脏免疫组化染色结果（×200）

3 讨论

肺纤维化属中医“肺痿病”，“阳虚”为肺纤维化发病之源。肺纤维化患者日久，阳气渐衰，导致血液和水液代谢异常，痰瘀形成。在病机上，则为阳虚寒凝、痰滞血瘀。根据国医大师洪广祥教授“治肺不远温”的学术思想，针对肺纤维化阳虚寒凝、痰滞血瘀之病机，本研究采用具有温化寒饮、化痰祛瘀功效的温肺化纤颗粒进行治疗。

肺纤维化是以肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞增殖活化以及细胞外基质大量沉积并伴有炎症细胞浸润为特征的间质性肺病。铁死亡是一种以铁离子沉积、ROS 和脂质过氧化物累积，以及谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达受抑制的细胞死亡方式。研究发现，该死亡形式的发生可导致成纤维细胞向成肌纤维细胞转化（FMT），导致肺脏发生病理损伤，最终形成肺纤维化，并在其机制中发生关键作用［9-10］。

研究发现，肺纤维化可伴随铁和脂质过氧化物代谢失衡现象［11-14］。当细胞内铁过量时，细胞代谢过程中生成的过氧化氢和超氧自由基阴离子会与胞内过量的铁发生Fenton 反应，并转化为对大分子物质具有高反应性的羟自由基，其中具有抗氧化应激的谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的含量降低，进而诱导细胞内大量的ROS 和脂质过氧化物累积，导致机体细胞保护系统的主要控制器核因子红细胞系2 相关因子2（Nrf2）含量降低，导致细胞损伤，并最终引发细胞发生铁死亡。

在本研究中，通过小鼠气管内滴注博来霉素，以模拟人肺纤维化发生。在HE 和Masson 染色结果中证实，小鼠肺脏组织出现明显的肺泡结构破损、肺泡壁增厚、纤维组织增生和蓝色胶原纤维沉积等肺纤维化表现。在进一步的检测中发现，肺纤维化小鼠肺脏中铁离子含量以及脂质过氧化物MDA 含量增加，抗氧化应激的GSH 含量降低，抑制铁死亡相关蛋白Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 表达明显降低，表明博来霉素诱导的小鼠肺纤维化可能是由于铁死亡发生所致。给予温肺化纤颗粒干预后，各组小鼠肺泡壁稍增厚，未见明显的肺泡结构破损，纤维组织增生和蓝色胶原纤维沉积得到明显改善，表明温肺化纤颗粒可有效减轻肺脏病理损伤。而在铁死亡相关检测中发现，各组小鼠肺脏中铁离子含量、脂质过氧化物MDA 含量明显减少，而抗氧化应激的GSH 含量增加，以及抑制铁死亡相关蛋白Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 表达明显增加，这表明温肺化纤颗粒可能通过抑制铁死亡达到改善肺纤维化的作用。

在本实验中，初步从动物实验对温肺化纤颗粒改善PF 的治疗做了简单的论述，对于温肺化纤颗粒抑制铁死亡的具体作用机制尚未阐述。今后本课题组将进行细胞实验，构建肺纤维化模型，探讨铁死亡在肺纤维化中发生的具体作用机制以及温肺化纤颗粒的干预作用。