保存方法对大洋性头足类多组织稳定同位素分析的影响：以茎柔鱼为例

沈永富，耿 亮，贡 艺,2,3,4，丁 宇，李云凯,2,3,4，邓江山，陈浩楠

1.上海海洋大学 海洋科学学院，上海 201306

2.大洋渔业资源可持续开发教育部重点实验室，上海 201306

3.国家远洋渔业工程技术研究中心，上海 201306

4.农业农村部大洋渔业开发重点实验室，上海 201306

由于稳定同位素在生物体内复杂的分馏机制，使得其特征值可用于示踪物质在生态系统中的流动过程[1]。通常，碳稳定同位素比值 (δ13C) 可用于指示食物来源[2]，氮稳定同位素比值 (δ15N) 可用于指示营养位置[3-4]。基于此，稳定同位素分析已成为海洋生物摄食生态学研究的主要技术手段[5]。

头足类广泛分布于全球各大洋，其资源丰富，具有极高的经济价值[6-7]。由于其世代更新快，生命周期短，在海洋生态系统的能量传递过程中起着关键作用[8-9]。基于不同组织稳定同位素周转率的差异，国内外学者应用稳定同位素技术对头足类摄食生态开展了大量研究。肌肉组织用于指示较长时间周期头足类的摄食和洄游过程[10]；性腺组织用于指示短时间周期的信息[11]；角质颚作为一种硬组织，结合时间序列连续取样，可用于示踪不同生活史阶段头足类的摄食与栖息地变化[12]。然而，不同研究中样品的保存方法存在差异，且均未考虑保存方式对分析结果的潜在影响，这增加了样品分析结果的不确定性。

保存方式是否会对稳定同位素分析造成影响尚存在争议。冷冻保存是稳定同位素样品最常见的保存方法，由于冷冻不涉及化学试剂，故通常认为冷冻对δ13C 和δ15N 分析无影响[13]。但有研究发现，冷冻会破坏细胞结构从而引起氧化反应，造成某些生物组织的稳定同位素比值发生变化[14]，例如罗氏沼虾 (Macrobrachiumrosenbergii) 整虾在冷冻条件下δ13C 呈现先下降后上升的趋势[15]。此外，体积分数为75%的乙醇和体积分数为38%的甲醛水溶液是实验室和博物馆保存样品的两种常规试剂，其对稳定同位素分析的影响存在较大争议。Hetherington 等[16]研究发现甲醛和乙醇保存会降低头足类肌肉中δ13C 值；而Kaehler 和Pakhomov[17]指出乙醇保存显著增大真蛸 (Octopusvulgaris)肌肉组织δ13C 值，δ15N 值则无显著性变化；Carabel 等[18]发现乙醇和甲醛保存均会增大槽沟海葵 (Anemoniasulcate)、帽贝 (Patellvulgate)和紫贻贝 (Mytilusgalloprovincialis) 的δ15N 值，而δ13C 值仅在紫贻贝中表现出显著下降。因此，各保存方法对不同物种、不同组织可能会产生特异性影响，然而目前针对大洋性头足类各组织的影响却鲜有报道，开展相关保存方法的比较研究有助于准确认识保存方法差异带来的潜在影响，为进一步规范样品保存提供理论依据。

本研究以大洋性头足类的典型代表—茎柔鱼 (Dosidicusgigas) 为研究对象，比较分析了其肌肉、性腺和角质颚在冷冻保存 (-20 ℃) 和试剂保存 (体积分数为75%的乙醇与体积分数为38% 的甲醛) 条件下，第0、第30 和第180 天的δ13C、δ15N和碳氮比 (C/N) 变化，进而分析得出茎柔鱼样品最优保存方法，以期为其他大洋性头足类稳定同位素分析和样本保存提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

茎柔鱼样品取自2020 年6 月秘鲁海域中国远洋鱿钓船渔获物，采样区域为84°W—95°W、3°S—7°S，共采集20 尾胴长范围为22.7～26.9 cm 的茎柔鱼，带回实验室后，于漏斗锁软骨处取一块约4 cm×4 cm 的肌肉，解剖取出性腺组织，并用镊子取出角质颚，洗净黏液及杂质后，装入自封袋中待进一步处理。

将各组织样品用超纯水洗净，等分为7 份：1 份作为对照组即刻处理，其余6 份分别采用-20 ℃冷冻、体积分数75% 的乙醇和体积分数为38% 的甲醛溶液保存30 和180 d。待到达保存时间后，使用超纯水洗净组织上残余保存液，随后装入5 mL 离心管在冷冻干燥机 (Christ Alpha 1-4 LD plus，德国) 于-55 ℃内冷冻干燥32 h。由于性腺组织含脂量较高，脂质在合成过程中会产生δ13C 分馏，导致脂类与其他成分 (如蛋白质和碳水化合物) δ13C 值存在差异，因此现有的研究中常进行脂类抽提。正常C/N 值小于3.5 时，认为脂质抽提完。本研究在测样前对性腺样品进行脱脂处理，即样品放于15 mL 离心管中，加入体积比为2∶1 的二氯甲烷甲醇溶液，浸泡20 h 后在离心机内以4 000 r·min-1的转速离心2 min，重复3 次。剩余沉积物在60 ℃烤箱中烘干去除残留溶剂。

1.2 稳定同位素分析

将干燥后的肌肉、角质颚和性腺样本使用球磨仪(Mixer Mill MM 400，德国) 研磨成粉，并用电子天平称取约1.50 mg 包装于锡箔纸中，随后送入稳定同位素质谱仪(IsoPrime 100，英国) 和元素分析仪 (vario ISOTOPE cube，德国) 测定碳、氮稳定同位素比值及元素含量百分比(C/N)。δ13C 和δ15N 的计算公式如下：

式中：X为δ13C 或δ15N (‰)；Rsample和Rstandard分别为所测得的同位素比值和标准品同位素比值。为保证实验结果精度和准确度，每隔20 个样品采用实验室标准物质[蛋白质，-26.98‰ vs.维也纳国际原子能中心制作的美洲拟箭石(PDB) 和5.94‰ vs.大气中的氮气 (N2)] 校正，δ13C 和δ15N 的分析精度分别为0.05‰和0.06‰。C/N 值由原子质量计算得出。稳定同位素测定在上海海洋大学稳定同位素分析实验室进行。

1.3 数据分析

使用配对t检验分析δ13C、δ15N 和C/N 值在各保存方式下的变异性，并分析各处理方式对稳定同位素比值影响的时间变化规律。使用SPSS 22.0 和Origin 2023 pro 软件进行统计分析和绘图。数据以“平均值±标准差 ()”表示，P＜0.05 表示有显著性差异。

2 结果

茎柔鱼肌肉、角质颚和性腺3 种组织δ13C、δ15N 和C/N 值在不同保存方式下的结果见表1。结果显示，3 种保存方法对茎柔鱼不同组织的稳定同位素比值造成了不同程度的偏移。

在冷冻保存第30 天时，肌肉和性腺组织中的δ13C 值与对照组相比，分别显著下降了 (-0.89±0.30)‰ 和 (-0.70±0.57)‰ (P＜0.05)，保存至第180 天则无显著性变化 (P＞0.05，图1)；在角质颚组织中冷冻保存则始终对其δ13C 值无显著性影响 (P＞0.05)；冷冻保存的3 种组织的δ15N 值始终表现为无显著性变化 (P＞0.05，图1)；C/N 值变化结果显示，仅肌肉和性腺组织30 d 内有上升趋势 (P＜0.05)，之后保持稳定，角质颚则始终无显著性变化 (P＞0.05，图1)。

在乙醇保存条件下，肌肉组织的δ13C 值表现为下降后逐渐稳定，保存第30 天的偏移量为 (-0.41±0.50)‰，而δ15N 值则相反，呈先升高后逐渐平稳，保存第30 天的偏移量为 (0.76 ±0.79)‰，C/N 值则表现为随时间变化始终增大(P＜0.05，图1)，第30 和第180 天的偏移量分别为 0.34±0.05 和 0.36±0.23；而乙醇保存对角质颚始终未造成显著性影响 (P＞0.05，图1)；在性腺组织中，其δ13C 值在第30 天时显著低于对照组 (P＜0.05)，且在第180 天时持续降低，第30 和第180 天总偏移量分别为 (-0.36±0.44)‰ 和 (-0.83±0.64)‰，δ15N 值则始终无显著性变化 (P＞0.05)，经保存后的C/N 值显著高于对照组，第30 和第180 天总偏移量分别为0.21±0.14 和0.70±0.82。

甲醛保存对3 种组织造成的影响最为显著。相比于对照组，3 种组织在保存第30 天时表现出类似的变化，即δ13C 和δ15N 值显著降低，C/N 值显著上升 (图1)，总偏移量分别为δ13C：(-3.03±1.87)‰，δ15N：(-0.48±0.72)‰，C/N：0.86±0.73，而保存第180 天的肌肉组织与第30 天时相比无显著性差异 (P＞0.05)，但角质颚的δ15N 值在第180 天出现上升趋势(P＜0.05)，但与对照组无显著性差异(P＞0.05)，角质颚和性腺的C/N 值在保存至第180 天时表现出持续升高，偏移量分别为0.31±1.07 和0.21±0.79。

3 讨论

稳定同位素技术的应用推动了海洋食物网结构和物质循环的深入研究，但对于测定结果是否受保存方法影响的研究仍欠缺，特别是对大洋性生物难以进行新鲜样本的检测，而保存对其不同组织的潜在影响尚不清楚。现有研究在测定分析前对不同组织的保存方法尚未达成统一的标准，这可能会影响各研究数据的可靠性与可比性，对物种营养级评估及生态位划分的准确性造成不利影响。本研究以大洋性头足类的代表性物种——茎柔鱼的肌肉、角质颚和性腺组织开展比较研究，分析了-20 ℃冷冻、75%乙醇与38% 甲醛溶液对各组织稳定同位素比值的影响及其差异。

本研究显示，冷冻保存会在短期内导致肌肉和性腺组织的δ13C 值下降、C/N 值上升，这与浮游动物[14]、帽贝(Patellavulgata)[18]以及罗氏沼虾[15]冷冻保存的研究结果相似。冷冻保存是目前稳定同位素研究中最常用的保存方法，一般认为冷冻保存只会使其样品组织内凝结形成冰晶，使得细胞体积增大，机械性破坏细胞结构，不会影响样品本身的化学组成，因此在实际应用中通常会忽略冷冻保存的潜在影响[13]。然而，Feuchtmayr 和Grey[14]指出，冷冻保存对稳定同位素测定结果的影响可能与细胞质浸出有关，由于组织细胞破裂使细胞液流出，会间接导致脂肪氧化和蛋白质氧化变性[19]，此类化学反应过程最终可能导致稳定同位素比值发生变化，但该化学过程还有待进一步确认。因此，未来需进一步探究冷冻保存的影响并获取合适的校正因子，但鉴于冷冻保存的影响程度有限，目前仍是最理想的方法。

乙醇保存常用于野外采样，也是头足类硬组织最常见的保存方法。本研究发现，乙醇保存对两种软组织 (肌肉和性腺) 的δ13C 值造成了显著性影响，而硬组织角质颚却未受影响；Bourg 等[20]的研究也发现乙醇保存会显著改变海星的δ13C 值；von Endt[19]指出乙醇可能会提取多种非极性脂类，如甘油三脂；Post 等[21]证实δ13C 与生物机体的含脂量呈正相关关系。因此，用乙醇提取含有大量C 元素脂质的软组织 (如性腺) 后会导致其δ13C 值降低。本研究中乙醇未完全提取净脂质，这可能是导致其δ13C 值在180 d 后仍下降的原因。与之相反，角质颚的主要成分为几丁质和蛋白质[22]，因此未观察到乙醇保存对其产生了影响。此外，乙醇保存对肌肉组织的δ15N 值也造成了显著性影响，这可能是由于乙醇除了提取脂质外，还可能会引起肌肉组织水解，导致蛋白质裂解而提取了部分含氮成分[23-24]，最终使δ15N 值发生变化。这也可能会间接引起软组织中C/N 值变化。总的来说，乙醇保存可能会导致稳定同位素值的偏移，因而可能会高估头足类的营养级，但不同组织可能存在差异，今后应谨慎使用此保存方法或在获得合理的校正因子后使用。

甲醛作为传统的样品防腐保存试剂，常在野外采样和博物馆中应用。本研究发现，甲醛会显著改变3 种组织的稳定同位素比值和C/N 值，且偏移量高于另两种方法，易造成其营养级和碳源的严重低估，这一现象在无脊椎动物[25]、底栖动物[26]的研究中也有类似报道。Bicknell 等[27]指出甲醛会促使富含δ13C 的化合物浸出，这一过程会在达到一定水平后停止而不再变化，因此，浸泡于甲醛中的组织的δ13C 值会在一定时间内降低。Umbricht 等[26]研究发现甲醛导致的蛋白质变性会造成氨基酸损失，并产生新的含氮物质，这可能造成δ15N 变化。上述反应中对C、N 元素的影响最终也会体现在C/N 值的变化上。值得注意的是，尽管甲醛会在30 d 内对角质颚的δ15N 造成显著性影响，但在第180 天时角质颚的δ15N 值恢复至初始值，这一现象可能与组织特异性有关[18,28]，具体原因仍需进一步探究。因此，在今后采样保存时应尽量避免使用甲醛试剂。

本研究中3 种保存方法均会对软组织的稳定同位素比值造成不同程度影响，从而引起营养级和生态位估算的偏差。但相比于乙醇和甲醛溶液保存，冷冻保存对肌肉和性腺组织稳定同位素测定结果的影响较小，冷冻保存作为目前最常见、便捷的保存方法，今后需进一步探究不同保存温度及时间对细胞物质流出、化学组分的影响，以优化样品保存过程。此外，冷冻保存和乙醇保存对硬组织角质颚均无显著性影响，表明目前硬组织最常用的保存方法可直接用于稳定同位素研究。综上所述，未来仍需加强保存方法对不同组织稳定同位素分析结果影响的研究，以进一步确定适合特定物种及其组织的保存方法，或建立公式对δ13C 和δ15N 的分析结果进行校正。

4 结论

本研究结果表明，甲醛和乙醇保存易对稳定同位素比值造成较大的偏移量，因此在头足类稳定同位素研究中应慎重选择这两种溶液保存样品。鉴于3 种方法均会对软组织 (肌肉和性腺) 稳定同位素分析造成显著性影响，建议对于头足类软组织样品尽可能及时处理并进行稳定同位素比值测定，而硬组织 (角质颚) 可采用冷冻或乙醇保存。