高效液相色谱法测定膦甲酸钠有关物质*

陈明,王姗姗,乔戈,李苗

(武汉药品医疗器械检验所,国家药品监督管理局药物制剂质量研究与控制重点实验室,武汉 430073)

膦甲酸钠为广谱非核苷类抗病毒药,可非竞争性抑制HIV的逆转录酶和乙型肝炎类病毒DNA多聚酶,临床用于敏感病毒所致的皮肤感染、黏膜感染、也可用于HIV感染者。膦甲酸钠是美国食品药品管理局最早期批准用于临床治疗艾滋病的16种药物之一[1-2],其制剂剂型主要包括膦甲酸钠氯化钠注射液、膦甲酸钠注射液、膦甲酸钠乳膏和膦甲酸钠滴眼液。HIV是严重危害人类身体健康的病原体,也是全球最受关注的公共卫生问题之一[3-8]。通过全球医药工作者持续不断的努力,现已有多种有效的新药和复方制剂用于治疗艾滋病。艾滋病正逐渐转变为一种可控的慢性传染性疾病[9-14]。

膦甲酸钠现行国家标准WS1-(X-187)-2004Z[15]和YBH07772006[16]均未控制有关物质。李苗等[17]采用离子色谱法测定膦甲酸钠氯化钠注射液中磷酸盐和亚磷酸盐,冮海峰等[18]采用HPLC法测定膦甲酸钠氯化钠注射液中磷酸盐和亚磷酸盐,国内几乎没有对膦甲酸钠原料药有关物质的相关研究报道。

膦甲酸钠质量标准《中华人民共和国药典》2020年版未收载。EP11.0[19]和USP43-NF38[20]均有收载,EP11.0与USP43-NF38膦甲酸钠项下均采用GC法控制杂质Ⅱ,HPLC法控制杂质Ⅰ及其他杂质。为优化膦甲酸钠杂质分析方法,本研究采用HPLC法同时控制杂质Ⅰ、杂质Ⅱ及其他杂质,简化了分析方法,提高膦甲酸钠的杂质分析效率,降低药品检验成本。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(美国AGILENT公司),XS105电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司,感量:0.01 mg)。

1.2试药 膦甲酸钠对照品(含CNa3O5P 64.3%,购自中国食品药品检定研究院,批号:100943-201001);杂质Ⅱ对照品(武汉大安制药,批号:201705002),杂质Ⅰ对照品(武汉大安制药批号:1.2),膦甲酸钠原料(济南金达药化有限公司,批号:JD-BP-29-20170704、JD-BP-29-20180902、JD-BP-29-20180905);冰醋酸、焦磷酸钠、无水硫酸钠及四己基硫酸氢铵,均为市售分析纯。

2 方法和结果

2.1色谱条件 色谱柱:用资生堂CAPCELL PAK C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相[取无水硫酸钠1.42 g,加冰醋酸3 mL与0.1 mol·L-1焦磷酸钠溶液6 mL,加水1 000 mL使溶解,作为溶液A;取无水硫酸钠1.42 g,加无水醋酸钠4.2 g与0.1 mol·L-1焦磷酸钠溶液6 mL,加水1 000 mL使溶解,作为溶液B;取溶液A-溶液B(70：30)混合溶液(pH值约为4.4)1 000 mL,加四己基硫酸氢铵0.25 g,振摇使溶解,加甲醇100 mL,摇匀];流速:1.0 mL·min-1;柱温:35 ℃;检测波长:230 nm;进样体积:50 μL。

2.2溶液的配制

2.2.1供试品溶液 取本品0.24 g,精密称量,置10 mL量瓶中,加冰醋酸0.5 mL润湿,加流动相适量,振摇使溶解,用流动相稀释至刻度,摇匀。

2.2.2对照溶液 精密量取供试品溶液适量,用流动相稀释制成每毫升约含膦甲酸钠48 μg的溶液。

2.2.3系统适用性溶液 取杂质Ⅰ对照品与杂质Ⅱ对照品各适量,用流动相溶解并稀释制成每1 mL中分别含杂质Ⅰ0.48 mg与杂质Ⅱ0.24 mg的溶液,作为杂质对照品储备液;取本品0.24 g,置10 mL量瓶中,加冰醋酸0.5 mL,振摇,加杂质对照品储备液1 mL,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀。

2.2.4灵敏度溶液 精密量取对照溶液适量,用流动相稀释制成每毫升约含膦甲酸钠7.2 μg的溶液。

2.3方法学验证

2.3.1系统适用性实验和专属性实验

(1)系统适用性实验 取流动相作为空白溶剂。系统适用性溶液、空白溶剂及样品溶液色谱图见图1。可见,系统适用性溶液色谱图中杂质Ⅰ峰与杂质Ⅱ峰均能与膦甲酸钠峰完全分开,而空白溶剂在相应保留时间上没有色谱峰出现。

A.空白溶液;B.系统适用性溶液;C.样品溶液;1.膦甲酸钠;2.杂质Ⅰ;3.杂质Ⅱ。图1 系统适用性实验的HPLC图谱 A.blank solution;B.system suitability solution;C.sample solution;1.foscarnet sodium;2.impurityⅠ;3.impurityⅡ.Fig 1 HPLC chromatograms for system suitability test

(2)专属性实验 取“2.2.1节”下的供试品溶液,分为5份,每份分别量取1 mL,①加入1 mol·L-1盐酸溶液0.1 mL,放置1 h,用1 mol·L-1氢氧化钠溶液中和,用流动相稀释至刻度;②加入1 mol·L-1氢氧化钠溶液0.1 mL,放置1 h,用1 mol·L-1盐酸溶液中和,用流动相稀释至刻度;③加入10%过氧化氢溶液0.1 mL,放置1 h,用流动相稀释至刻度;④取供试品溶液,在日光下光照24 h;⑤取供试品溶液,100 ℃水浴下加热30 min。对5份溶液进行测定,色谱图见图2,降解产物与膦甲酸钠的分离度均符合要求。

D.酸破坏样品;E.碱破坏样品;F.氧化破坏样品;G.光破坏样品;H.高温破坏样品;1.膦甲酸钠。图2 专属性实验的HPLC图谱D.sample treated with acid;E.sample treated with alkali;F.sample treated with oxidation;G.sample treated with UV light;H.sample treated with high temperature;1.foscarnet sodium.Fig 2 HPLC chromatograms of specificity test

2.3.2线性关系考察 精密称取膦甲酸钠对照品12 mg,置50 mL量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀。分别精密量取适量,加流动相稀释制成每毫升分别约含5、25、50、124、248 μg的溶液,照本研究的色谱方法测定,以浓度(C)为横坐标,峰面积(A)为纵坐标进行线性回归,回归方程为:A=1.8C+9.8×10-4,r=0.999 9;线性范围为5～248 μg·mL-1。精密称取杂质Ⅱ对照品,用流动相制成每毫升含杂质Ⅱ分别1.6、3.2、4.5、6.8、9.1 μg的溶液,照本研究的色谱方法测定,以浓度(C)为横坐标,峰面积(A)为纵坐标进行线性回归,回归方程为:A=2.5×103C+3.2×102,r=0.999 9;线性范围为1.6～9.1 μg·mL-1。

2.3.3精密度试验 取“2.2.2节”下的对照溶液,精密量取50 μL注入液相色谱仪,连续进样6次,膦甲酸钠主峰的保留时间与峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.0%和1.1%。精密量取浓度为2.4 μg·mL-1杂质Ⅱ溶液50 μL注入液相色谱仪,连续进样6次,杂质Ⅱ峰的保留时间与峰面积的RSD分别为0.0%和0.8%。

2.3.4检出限 按本研究色谱方法测定,膦甲酸钠和杂质Ⅱ的检出限分别为23 ng和62 ng(S/N=3)。

2.3.5加样回收率实验 精密称取已测定有关物质的供试品0.24 g,共12份,分为3组,置于10 mL量瓶中,分别制备含杂质Ⅱ为0.05%、0.15%的溶液各3份,含杂质Ⅰ0.2%与杂质Ⅱ0.1%的溶液6份。结果表明该方法杂质Ⅰ、杂质Ⅱ回收率良好,见表1。

表1 杂质Ⅰ加样回收率实验结果Tab.1 Results of recovery test of impurity Ⅰ n=6

2.3.6溶液稳定性试验 取“2.2.1节”下的供试品溶液和“2.2.3节”下的系统适用性溶液,进行溶液的稳定性考察。室温下放置0、2、4、8、12和24 h后分别进样50 μL,记录色谱图,其中供试品溶液在24 h内均未检出杂质峰;系统适用性溶液在24 h内均可检出杂质Ⅰ和杂质Ⅱ,但峰面积有减小趋势,见表2,表3,因此采取本研究方法测定膦甲酸钠有关物质时各样品溶液应临用新制。

表2 杂质Ⅱ加样回收率实验结果Tab.2 Results of recovery test of impurity Ⅱ n=12

表3 系统适用性溶液稳定性实验结果Tab.3 Results of stability test of system suitability solution

2.3.7样品的测定 按“2.2.1节”下方法制备供试品溶液进行测定,3批样品均未检出杂质Ⅰ、杂质Ⅱ及其他杂质。

3 讨论

USP43-NF38和EP11.0膦甲酸钠项下均为HPLC法控制杂质Ⅰ及其他杂质,GC法控制杂质Ⅱ,HPLC法供试品溶液均以流动相作溶剂制备含膦甲酸钠2.4 mg·mL-1的溶液。本研究发现,膦甲酸钠杂质Ⅱ结构中含有多个酯键,在碱性条件下容易降解,照USP43-NF38及EP11.0制备供试品溶液时,由于膦甲酸钠浓度较高使供试品溶液呈碱性,其中杂质Ⅱ会快速降解,配制后立即进样与放置36 min后分别测定,可以检测到杂质Ⅱ峰面积快速变小。本研究对USP43-NF38及EP11.0方法进行优化,将供试品溶液与系统适用性溶液的制备过程调整为:取膦甲酸钠先加少量冰醋酸湿润,再加流动相振摇数分钟即可完全溶解,既可缩短供试品溶液的制备时间,又可调节溶液的pH值至弱酸性,防止杂质Ⅱ的快速降解,可得到较稳定的供试品溶液和系统适用性溶液。

有关物质是药品质量研究中关键性的项目之一,现已成为药品质量标准中不可或缺的一项[21-22]。本研究通过优化USP43-NF38及EP11.0膦甲酸钠项下有关物质检查的色谱方法,建立了HPLC法测定膦甲酸钠有关物质,同时控制杂质Ⅰ、杂质Ⅱ及其他杂质,并进行了方法学验证,该方法操作简便,专属性好,结果准确,有利于提高膦甲酸钠的杂质分析效率,实现药品检验经济学的目标。