褪黑素对消炎痛所致胃溃疡小鼠的保护作用机制

田华, 张占华, 李晓利, 刘奇, 黄静

西安交通大学附属红会医院 1.老年病科,2.急诊科,3.儿科,4.临床药学科,陕西西安 710054

胃是容易受到外界因素影响的器官,各种因素都会导致胃溃疡形成[1-2]。临床上消炎痛可引起胃酸释放和胃蛋白酶活性增加,黏液层和碳酸氢盐释放减少;同时也引起胃黏膜脂质过氧化和活性氧(reactive oxygen species,ROS)形成增加[3]。褪黑素是一种有效的ROS代谢清除剂和抗氧化剂,可促进胃肠道分泌、运动、消化和吸收[4]。此外,褪黑素还具有抗炎功能,有助于保护胃肠黏膜[5];但是褪黑素在消炎痛诱导胃溃疡中作用未见相关报道。本研究旨在探讨褪黑素在消炎痛诱导小鼠胃溃疡模型中的保护作用及机制。

1 材料和方法

1.1 实验仪器和主要试剂

光学显微镜(日本OLYMPUS公司);总抗氧化态(total antioxidant status,TAS)、总氧化态(total oxidant status,TOS)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6、IL-10检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);消炎痛、兔源多克隆核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)和Caspase-3抗体(美国Sigma公司)。

1.2 实验动物及分组

40只5周龄雄性BALB/c小鼠(22～28 g),购于西安交通大学动物中心,室温下自由进食和饮水。将BALB/c小鼠随机均分成对照组、溃疡组、低剂量褪黑素组和高剂量褪黑素组,每组10只。对照组仅腹腔注射二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)。溃疡组小鼠皮下注射2.5 g/L消炎痛NaHCO3溶液[6]。低剂量、高剂量褪黑素组分别用褪黑素1、5 mg/kg预处理,24 h后注射消炎痛。造模成功7 h后,全麻处死各组小鼠,收集胃组织待用。

1.3 ELISA检测

各组小鼠胃组织在10%冰冷磷酸盐缓冲液中匀浆,4 000 r/min离心,取上清液。按照ELISA试剂盒说明书检测胃组织中TAS、TOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平。氧化应激指数(oxidative stress index,OSI)=TOS/TAS。

1.4 组织病理学分析

各组小鼠胃组织用10%福尔马林缓冲液固定,石蜡包埋,4 μm连续切片。HE染色,显微镜下评估各组胃组织损伤程度[7]。

1.5 免疫印迹分析

提取各组小鼠胃组织100 mg,加入全细胞裂解液2 mL,匀浆、超声破碎,BCA法进行蛋白定量,制备成电泳样品。取30 μg电泳样品进行SDS-PAGE电泳,然后转至PVDF膜上。经5%牛奶孵育1 h。分别用兔源NF-κB(1∶1 000)和Caspase-3(1∶1 000)4 ℃孵育3 h。用山羊抗兔二抗(1∶10 000),室温孵育1 h。采用Quantity one图像分析软件对目标条带进行分析。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组小鼠TAS、TOS、OSI及炎症细胞因子比较

与对照组比较,其他各组TAS、TOS、OSI水平升高(P<0.05);溃疡组TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平升高(P<0.05)。与溃疡组比较,高剂量褪黑素组TAS水平升高,TOS和OSI水平降低(P<0.05);低剂量和高剂量褪黑素组TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平降低(P<0.05)。与低剂量褪黑素组比较,高剂量褪黑素组TNF-α和IL-1β降低(P<0.05;表1)。

表1 褪黑素对小鼠TAS、TOS、OSI及炎症细胞因子的影响

2.2 褪黑素对小鼠胃溃疡的影响

对照组胃黏膜层由单层柱状上皮组成,排列整齐。溃疡组胃黏膜层上皮坏死、脱落、炎症细胞浸润及出血严重。低剂量褪黑素组胃黏膜层上皮坏死、脱落、炎症细胞浸润及出血较溃疡组改善。高剂量褪黑素组胃黏膜层上皮坏死、脱落、炎症细胞浸润及出血较低剂量褪黑素组减轻(图1)。

图1 各组小鼠胃组织病理检测结果(HE染色,200×) 箭头表示出血处。

2.3 褪黑素对小鼠NF-κB和Caspase-3的影响

与对照组比较,其他各组小鼠胃组织中NF-κB和Caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05)。与溃疡组比较,高剂量褪黑素组胃组织中NF-κB和Caspase-3蛋白表达水平降低(P<0.05;图2、表2)。

图2 各组小鼠胃组织典型NF-κB和Caspase-3表达

表2 各组小鼠NF-κB和Caspase-3比较

3 讨 论

胃溃疡为常见的胃肠道疾病,临床上主要是由于服用非甾体抗炎药而导致出血和黏膜病变[8]。研究证实,消炎痛会引起严重胃肠道损伤和氧化应激[9];消炎痛诱导胃溃疡主要是通过ROS生成[10]。临床上,胃溃疡通常采用组胺-2受体阻滞剂或质子泵抑制剂治疗,但长期使用会引起不良反应。研究表明,褪黑素在应激性溃疡模型中对胃溃疡有保护作用[5],但是对于消炎痛引起胃溃疡损伤的机制仍不明确。

消炎痛诱导溃疡模型显示胃溃疡过程中ROS产生,导致细胞蛋白氧化和抗氧化剂耗竭[11]。ROS也可引起氧化损伤,破坏抗氧化防御系统。TAS被广泛用于测定总抗氧化能力[12]。OSI是一种能显示脂质、蛋白质氧化和DNA损伤指标,而DNA损伤是由于氧化剂增加或抗氧化剂减少而产生的非代偿性自由基引起的。本研究结果显示,在消炎痛诱导溃疡中,褪黑素升高TAS,降低TOS和OSI。NF-κB在溃疡愈合过程中起着重要作用,胃溃疡期间组织中NF-κB激活增加[13]。NF-κB也在调节免疫反应中起着重要作用,并触发IL-6、IL1-β和TNF-α等促炎症细胞因子转录上调[14]。在本研究中,褪黑素可能通过NF-κB信号通路降低诱导期炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10)水平来减轻消炎痛诱导胃溃疡。细胞凋亡是免疫系统发育和组织重建过程中,清除正常细胞的调节过程。细胞凋亡调节障碍与多种疾病有关。在消炎痛诱导消化性溃疡研究中发现Caspase-3水平升高[15]。在另一项研究中,褪黑素能减少黑质中线粒体DNA损伤,并减少ROS产生,抑制细胞凋亡[16]。在本研究中,与对照组比较,溃疡组Caspase-3水平升高,褪黑素预处理后,Caspase-3水平降低。褪黑素的胃溃疡保护机制可能是通过抑制凋亡而发挥作用。

总之,本研究结果提示,褪黑素可能通过NF-κB来调节炎症细胞因子,以及调节细胞凋亡在消炎痛诱导胃溃疡小鼠中发挥保护作用。