激素浓度和培养条件对丹参组培快繁的影响

李玉梅，高玉民，朱彦威，毛伟芳，赵文利，吴云强，王志芬*

（1.济南市农业科学研究院，山东济南 250316；2.山东省农业科学院经济作物所，山东济南 250100）

0 引言

丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根茎，属于大宗常用中药材之一，其根含有多种生物活性物质，主要化学成分为丹参酮、丹酚酸等化合物，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦和凉血消痈的功效[1]。随着丹参药用价值的不断开发利用，市场需求量增加，丹参野生资源不能满足市场需求，而人工栽培由于药田生物群落多样性差，病虫害的大量发生以及只种不选的生产模式，大大降低了丹参的品质和产量，严重制约了丹参产业的健康快速发展，促使丹参组培快繁成为人们研究的热点[2]。利用现代生物技术组培快繁对丹参进行提纯复壮，提供优质无病虫害的种苗，为大批量生产丹参优质种苗奠定基础，对提高丹参产量及品质有着非常重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

以丹参植株叶片为外植体，以6-BA、NAA和2，4-D三种激素不同浓度配比，优化配方和培养条件，研究不同种类和浓度的植物生长调节剂对丹参叶片愈伤诱导、芽增殖以及生根的影响。丹参优选植株，由济南岳圣中药材种植合作社提供。MS培养基，购自石家庄纽春特组培科技有限公司的成品培养基。高压灭菌锅为江阴滨江医疗设备有限公司生产，型号LS-150LD。试验用药品2.4-D、6-BA、NAA由济南普朗特生物科技有限公司提供，纯度≥99%。

1.2 方法

1.2.1 外植体处理和愈伤诱导培养

1）愈伤培养基制备。根据丹参培养基配方配置培养基备用。培养基pH值灭菌前调制为6.2，灭菌后5.8～6.0。接种后，统计不同激素配比的培养基对丹参愈伤诱导的影响。

2）丹参叶片选取与处理。选取芽尖幼嫩叶片，放入三角瓶，用密纱布扎口。①用自来水流水冲洗15 min，除去外植体上的泥沙灰尘。②将初次处理过的外植体置于超净工作台，先放入无菌瓶，用无菌水摇晃冲洗2～3次；再用浓度75%的乙醇溶液晃动灭菌15～20 s，无菌水冲洗4次；然后用0.1%的氯化汞溶液灭菌处理（因丹参叶片密被绒毛，灭菌时，可加入几滴吐温-80，有助于彻底杀菌）。处理时间分别设置为5 min、7 min、10 min、12 min、15 min，共5个梯度，无菌水分别冲洗4～5次，其间一直晃动。③在无菌培养皿内，用无菌剪子把叶片剪成3 mm×5 mm大小，修掉叶缘，用无菌镊子放入目标愈伤培养基，进行愈伤培养。④1个培养瓶接种1个外植体，共50瓶。于培养室报纸遮光暗，培养7天后，定期观察外植体愈伤产生情况及污染情况，15天后开始统计愈伤诱导率和污染率。愈伤诱导率＝愈伤产生数／接种数×100%，污染率＝污染数／接种数×100%。培养条件：培养温度（23±2）℃。

1.2.2 芽增值继代培养

不同浓度的6-BA和NAA激素组合对丹参芽增殖的影响，采用双因素完全随机区组试验设计，分别设置激素6-BA浓度为2.0、1.5、1.0、0.7、0.5、0 mg/L，对应NAA浓度分别为1.0、0.8、0.5、0.3、0.3、0 mg/L，组成6个试验处理，MS为基本培养基，配置灭菌处理待用。在芽增殖培养基的组培瓶内，1瓶接种愈伤块4个，1块大小0.3 mm×0.5 mm，1个处理20瓶，共160瓶。pH值为5.8～6.2。培养条件：培养温度（24±2）℃，光照强度为培养瓶外4 500 lx、培养瓶内1 500～2 000 lx，光照时间为12 h/天。培养20 天后，观察生长情况并统计芽增殖系数。芽增殖系数＝芽增殖数/接种数×100%。

1.2.3 丹参组培苗的生根培养

将高约3 cm的组培苗，无菌操作条件下，剪成1 cm长节段，至少带一叶一芽，分别接种在含有不同NAA浓度的培养瓶中进行生根培养。1/2MS为基本培养基，NAA浓度分别为0、0.3、0.5、0.7 mg/L，共4个处理，1个处理接种20瓶，接种5 株/瓶，共100株，pH值为6.2。培养条件：培养温度（24±2）℃，光照强度4 500 lx，光照时间12 h/天。培养7天后，开始观察无菌苗的生根情况，40天后，统计生根率。生根率＝生根数/接种数×100%。

1.2.4 温度对丹参组培苗生长的影响

将高0.5 cm左右的带腋芽茎段接种在芽增殖培养基中，置于不同温度的光照培养室中进行培养。培养温度分别为19℃、21℃、23℃、25℃、27℃、29℃，光照强度4 500 lx，光照时间为12 h/天。培养10天后观察生长情况，统计丹参组培苗生长情况。

1.2.5 光照强度对组培苗生长情况的影响

将高度1 cm左右的带腋芽茎段或幼苗分别接种在芽生长培养基中。设定光照强度分别为1 500 lx、3 000 lx、4 500 lx、8 000 lx，设定光照时间分别为12 h/天，培养温度为（23±2）℃。培养10天后，观察丹参组培苗生长情况。

2 结果与分析

2.1 不同0.1%氯化汞溶液灭菌时间对丹参叶片污染率和愈伤诱导率的影响

可以看出，0.1%的氯化汞溶液给丹参叶片灭菌，最佳灭菌时间10～12 min。在一定时间段内，随着灭菌时间的增加，污染率降低，愈伤诱导率增加。当灭菌时间超过12 min，出现褐化，随着灭菌时间增加，褐化增加，诱导率降低（表1）。

表1 不同消毒时间对污染率和愈伤诱导率的影响

2.2 不同激素配比的培养基对丹参愈伤诱导的影响

可以看出，配方①愈伤产生率高，愈伤组织生长状况良好，芽分化时间早，适合丹参叶片愈伤组织培养（表2）。

表2 不同激素配比的培养基配方对丹参愈伤诱导的影响

2.3 6-BA和NAA激素的不同浓度组合对丹参芽增殖的影响

可以看出，6-BA 1.0 mg/L和NAA 0.5 mg/L激素组合配方，为最佳组合，增值倍数高达12.6倍，芽叶生长正常，无玻璃化现象（表3）。

表3 6-BA和NAA激素的不同浓度组合对丹参芽增殖的影响

2.4 NAA的不同浓度对丹参组培苗生根的影响

可以看出，NAA浓度为0.5 mg/L时，生根率98%，根长4～6 cm，基部根粗0.1～0.2 mm，单株根条数4根以上，适宜丹参组培苗生根培养（表4）。

表4 NAA的不同浓度对丹参组培苗生根的影响

2.5 培养温度对组培苗生长的影响

可以看出，培养温度在（23±2）℃范围内，叶色、株高、茎粗及节间长度都符合丹参试管苗的生长需要（表5）。

表5 培养温度对组培苗生长的影响

2.6 光照强度对组培苗生长的影响

可以看出，光照强度为4 500 lx时，丹参组培苗生长指标正常（表6）。

表6 光照强度对组培苗生长的影响

3 结论

丹参组织培养技术可以使选育的丹参良种在短时间内大量快速繁殖，也可解决因长期营养繁殖导致的品种退化和携带病毒等问题，而确定适合的组织培养条件是关键。实验在前人研究[2-4]基础上，研究了激素浓度和培养条件对丹参组培技术的影响。

1）用0.1%的氯化汞溶液给丹参叶片灭菌，最佳灭菌时间10～12 min。

2）丹参组培最佳培养基：叶片诱导愈伤培养基为MS（40 g/L）+6-BA（3.0 mg/L）+NAA（0.5 mg/L）+2.4-D（0.01 mg/L）；丛生芽最佳诱导培养基为MS+6-BA（1.0 mg/L）+NAA（0.5 mg/L）；最佳生根培养基为1/2MS+NAA（0.5 mg/L）。

3）丹参组培苗的最佳生长温度为（23±2）℃，光照强度4 500 lx左右，组培苗株高、叶色、茎粗及节间长度符合丹参组培苗生产要求，移栽炼苗成活率高。丹参组织培养只有在适宜的温度和光照强度下，组培苗才能生长正常。

4）对温度与光照影响丹参组培苗生长进行了观察，温度与光照对生根的影响则有待进一步研究。建议要考虑丹参品种间差异的影响，以使丹参组织培养技术进一步优化，建立指导性强的丹参组织培养技术体系，提高丹参组培育苗技术要领，节约成本且创造更高的经济效益。