QuEChERS 结合超高效液相色谱-串联质谱法测定砂仁中4 种黄曲霉毒素

陈昊文，周春霞，陈金，冼燕萍，管晶晶，胡均鹏，罗东辉,3*

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东海洋大学食品科学与工程学院，广东湛江 524088）（2.广州质量监督检测研究院，广州市食品安全风险动态监测与预警研究中心，广州市食品安全检测技术重点实验室，广东广州 511447）（3.化学与精细化工广东省实验室潮州分中心（韩江实验室），广东潮州 521000）

砂仁（Fructusamomi）为我国“四大南药”之一，距今已有1 300 多年的用药历史。药理作用研究表明，砂仁具有潜在的胃肠保护、抗炎、镇痛、止泻、抑菌、调节菌群、降血糖、抗氧化等作用[1-3]。砂仁“药食同源”，在我国的传统饮食里还是一种常用的芳香调味料[4]。由于受气候地域等条件的影响，砂仁在运输、储藏过程中极易受到真菌的污染而产生毒素的残留[5]，对消费者的健康产生潜在危害，世界卫生组织（WHO）已经将真菌毒素的监测归入食品安全的重点监控项目[6]，因此需要加强对砂仁中真菌毒素的检测和监控，以保障消费者的饮食安全。

在各种真菌毒素中，由黄曲霉和寄生曲霉两类霉菌代谢所产生的黄曲霉毒素，因具备高毒性、致癌性、致畸性和致突变性等危害而成为重点关注对象，其中自然界以B 族和G 族的黄曲霉毒素较为常见，包括黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、黄曲霉毒素B2（Aflatoxin B2，AFB2）、黄曲霉毒素G1（Aflatoxin G1，AFG1）和黄曲霉毒素G2（Aflatoxin G2，AFG2），它们的分子结构如图1 所示，黄曲霉毒素因拥有双呋喃环这一基本毒素结构，辅以致癌结构氧杂萘邻酮，成为危害人体的剧毒物质[7]。国际癌症研究机构已将黄曲霉毒素视为IA 类致癌物，许多国家已经对该类毒素制定了严格的食品限制指标[8]，我国GB 2761-2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中也规定了AFB1 在多种食品基质中的限量[9]，可见我国在食品中黄曲霉毒素的残留限量方面给予了高度重视，为此建立准确、快速的相关检测方法具有重要意义。

图1 4 种黄曲霉毒素的结构式Fig.1 Structure formula of 4 aflatoxins

目前，黄曲霉毒素的主要检测方法有薄层色谱法（TLC）[10]、酶联免疫法（ELISA）[11]、高效液相色谱法（HPLC）[12]、气相色谱法（GC）[13]等等，由于砂仁基质的复杂性与毒素检测的痕量性，上述检测方法有着检测步骤繁琐、时间长、灵敏度相对较低、易出现假阳性等问题[14]，在应用方面受到限制。近年来，超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）由于具备优良的分离能力与鉴定能力，被广泛用于测定各种食品基质中的真菌毒素。此外，目前黄曲霉毒素检测的净化手段主要采用免疫亲和柱法[15]，但该法检测成本高、耗时长的缺点也不利于日常的大批量检测。而操作简便的QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）净化法价格低廉，不仅能快速高效地去除基质杂质，而且能减少化学试剂的使用，目前在各类食品中真菌毒素的检测领域上有着良好的应用[16,17]。经查阅文献，采用QuEChERS-UPLC-MS/MS 法测定砂仁样品中真菌毒素的研究尚未见报道，考虑到检测机构的成本及样品基质的复杂程度，本研究建立了适用于测定砂仁中4种黄曲霉毒素的QuEChERS结合超高效液相色谱串联质谱法，以期填补液质联用技术在检测砂仁真菌毒素的空白。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ACQUITYTM 超高效液相色谱、Waters XevoTM TQ MS 三重四级杆串联质谱仪，美国Waters 公司；ACQUITY BEH C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、ACQUITY HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），美国Waters 公司；ME204 电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；MS3 digital 涡旋混合器，德国IKA 公司；KDC-40 低速离心机，安徽中科中佳公司；Milli-Q 去离子水发生器，美国Millipore 公司；KQ-500E 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

4 种黄曲霉毒素（Aflatoxin B1、B2、G1、G2）混合标准溶液（10 μg/mL），天津阿尔塔科技有限公司；甲醇（HPLC 级），德国Merk 公司；乙腈（HPLC 级），德国Merk 公司；甲酸（HPLC 级），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸铵（HPLC 级）、PSA、C18、GCB，上海安谱有限公司；无水硫酸镁、氯化钠，广州化学试剂厂；实验用水均为超纯水。

1.2 样品前处理方法

提取：称取研磨后的砂仁试样2 g（精确至0.01 g）于50 mL 塑料离心管中，加入5 mL 超纯水静置5 min，使其浸润样品，再加入5 mLφ=1%甲酸-乙腈溶液涡旋2 min，超声提取10 min，然后加入1.2 g 无水硫酸镁和0.4 g 氯化钠，涡旋2 min，4 200 r/min 离心5 min，取出上清液，重复萃取两次，合并提取液。

净化：吸取1.5 mL 上述清液至含有180 mg C18、150 mg PSA 和300 mg 无水硫酸镁的2 mL 离心管中，涡旋振荡2 min 除去杂质，12 000 r/min 离心5 min，上清液经0.22 μm 有机滤膜过滤后，将滤液置于2 mL进样小瓶中，供UPLC-MS/MS 测定。

1.3 色谱条件

UPLC-MS/MS 检测色谱条件：ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（1.8 µm，2.1 mm×100 mm）；流速：0.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：2 μL；流动相：0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸铵溶液（A）和乙腈（B）；梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.4 质谱条件

电离方式为电喷雾正离子（ESI+）模式；毛细管电压2 kV；离子源温度150 ℃，去溶剂温度400 ℃；去溶剂气为氮气，800 L/Hr；锥孔气为氮气，150 L/Hr；监测模式：多反应监测（MRM），4 种黄曲霉毒素的相关质谱参数如表2 所示。

表2 4 种黄曲霉毒素的质谱参数Table 2 MS/MS parameters of 4 aflatoxins

表3 4 种黄曲霉毒素的线性方程、相关系数、线性范围、检出限、定量限和基质效应Table 3 Linear equation,linear range,correlation coefficient (R2),LOD,LOQ and ME of 4 aflatoxins

1.5 标准溶液配制

准确移取质量浓度为10 μg/mL Aflatoxin B1、B2、G1、G2 的混合标准溶液1 mL 于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至10 mL，配制成1 μg/mL 的混合标准溶液储备液，于-18 ℃保存备用。

标准品混合中间液（100 μg/L）：准确移取4 种化合物的混合标准溶液1 mL 于10 mL 容量瓶，用乙腈定容到10.00 mL，此时各化合物质量浓度均为100 μg/L，于4 ℃保存。

标准曲线工作液：用乙腈溶液稀释混合中间液（或根据基质效应使用空白基质溶液稀释），配制系列标准曲线为0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/L。

1.6 数据处理

所有试验进行3 次平行，采用Origin 2021 pro 软件进行作图。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

MRM 模式由于具有良好的选择性，能同时扫描多化合物多离子对[18]，为获得4 种化合物最佳灵敏度和分离效果，本实验对每个目标化合物的质谱参数进行了优化。采用直接进样的方式，在电喷雾正离子（ESI+）模式下分别对4 种黄曲霉毒素混合标准工作液（100 μg/L）进行一级质谱扫描，寻找目标化合物的母离子信息，通过对标准品扫描后发现，4 种化合物在电离后均产生了[M+H]+峰，因此均采用[M+H]+作为其分子离子峰；4 种目标化合物的母离子经碰撞后，分别对其进行二级质谱扫描，得到相应的二级质谱图，确定两个子离子（响应值较高、质量数较大）分别作为定性、定量离子，并优化得到每种黄曲霉毒素特征离子对的最佳质谱参数，使特征离子对响应最高[19]。经优化后的特征离子对及质谱参数见表2。

2.2 色谱条件的优化

色谱柱是液相色谱的灵魂，是保证多分析物能良好分离的关键。由于化合物AFB1 和AFG1 的结构与极性较为相似，本研究比较了ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（1.8 µm，2.1 mm×100 mm）和ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（1.7 μm，100 mm×2.1 mm）对目标化合物的分离效果。运用相同的实验条件，使用质量浓度为2 μg/L的黄曲霉毒素混合标准溶液上机检测，结果发现，ACQUITY UPLC HSS T3 柱能够在6 min 内较好的分离4 种化合物，获得最优的峰型与响应强度，原因在于HSS T3 作为极性较强的色谱柱，本质上是在C18 键合相基础上加上了极性基团修饰，辅以高纯度的合成硅胶作为基体，使得该色谱柱对高比例水相及低pH 的耐受性更好，故选择ACQUITY UPLC HSS T3 柱作为分析色谱柱。

在反相液相色谱中，甲醇-水、乙腈-水等是较为常用的流动相体系，为了改善峰型和提高离子化效率可以向水相中添加少量甲酸、乙酸铵等试剂[20]。因此，本研究以甲醇、乙腈分别与纯水、φ=0.1%甲酸水溶液、5 mmol/L 乙酸铵水溶液、φ=0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸铵组成流动相，比较4 种真菌毒素的出峰情况。结果表明，不同流动相能在一定程度上影响目标化合物的出峰时间和响应值。由于乙腈较强的洗脱能力，选择乙腈为有机相的流动相体系相比甲醇而言，柱压明显降低，这对于仪器保护和检测效率而言更为有利。综合比较以乙腈为有机相的流动相组合的出峰效果与响应强度，发现以乙腈与0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸铵溶液组合作为流动相时，4 种黄曲霉毒素的保留时间稳定，且色谱峰形和响应强度最好，因此将其确定为该方法的最佳流动相组合，最佳梯度洗脱条件通过改变不同时间段流动相的比例进行确定，目标毒素的提取离子流图如图2 所示。

图2 4 种黄曲霉毒素的提取离子流图Fig.2 Extracted ion chromatogram of 4 aflatoxins

2.3 提取条件的优化

不同类型的提取溶剂因其极性和溶解性的差异会影响目标化合物的提取效果，多数真菌毒素易溶于有机溶剂，而目前甲醇和乙腈两种溶剂常被用于毒素的提取，此外，向提取溶剂中添加酸对某些真菌毒素的提取具有正向作用[21]，降低提取系统的pH 值有利于促进部分毒素在有机相中的分布[22]，因此，本研究选择基质较为复杂的阳春砂仁作为代表性基质，进行加标回收实验，考察了甲醇、乙腈、1%甲酸-甲醇、1%甲酸-乙腈对目标化合物回收的影响，不同提取溶剂对黄曲霉毒素的提取效果及回收率结果见图3、图4。

图3 4 不同提取剂的提取效果Fig.3 Extraction effect of different extractant

图4 4 不同提取剂对黄曲霉毒素回收率的影响Fig.4 Effect of different extractant on recovery of 4 aflatoxins

实验表明，使用乙腈组提取的回收率要远远高于甲醇组的回收率，当使用乙腈作为提取溶剂时，4 种黄曲霉毒素的回收率在64.48%～125.81%之间，而用甲醇作为提取溶剂时，4 种黄曲霉毒素的回收率最高仅达52.34%（图4）。这是由于甲醇比乙腈具有更好的溶解性，易将样品中的非目标成分提取出来，使得样品中的其他基质进入到提取液中，获得的提取物颜色过深，干扰后续的盐析和净化步骤，进而导致目标化合物的电离信号受到抑制[23]，使用甲醇时的共萃取现象导致低回收率的结果在肉豆蔻[20]基质的相关研究中也有报道，该研究同样选择了乙腈对多种真菌毒素进行提取。乙腈的极性适中，使用时能减少共萃取物的干扰，从而获得较为理想的回收率，同时可以观察到使用酸化后的乙腈作为提取剂时，目标化合物的回收率在69.81%～104.95%，整体与纯乙腈的回收率相比更接近于100%，因此选择1%甲酸-乙腈作为提取剂。

在QuEChERS 前处理过程中加入盐析剂可以促进目标化合物从水相进入有机相，利于水相和有机相的相互分离，从而提高化合物在提取时的回收率[24]。本实验选择无水MgSO4和NaCl 两种较为常见的盐析剂，并对其用量进行优化，由于MgSO4具有干燥放热特性，能诱使极性化合物从水相往有机相迁移，利于目标化合物的回收[20]，然而当MgSO4的量超过1.2 g时，整个样品体系的加热情况和结块程度明显，导致提取液无法完全取出，影响对目标毒素的回收。参考Zhang 等[25]研究中的类似现象并结合本实验结果，我们优化确定盐析剂的使用剂量为1.2 g 无水MgSO4和0.4 g NaCl。

2.4 净化条件的优化

考虑到砂仁基质中含有酚类、多糖、色素等干扰物质[26]，这些化合物不仅会影响目标物的响应值，同时会对仪器造成一定的污染，影响仪器寿命，因此在进样之前需要对提取液进行QuEChERS 技术净化[27]，不同净化剂对黄曲霉毒素的除杂效果及回收率结果见图5、图6。PSA、C18和GCB 作为三种常见的净化吸附剂，被广泛用于除去基质中杂质；C18可用于吸收基质中的非极性成分和脂肪类物质，PSA 是一种弱阴离子交换剂，可有效去除有机酸、脂肪酸、色素等成分，GCB 对含苯结构的有机化合物有较好的吸附能力[28]。同时，加入无机盐能去除有机相中的水分并将基质中的非目标干扰物保留在水层，利于真菌毒素溶入有机相的同时提高溶液电离强度[29]，从而提高回收率。本实验考察了三种净化剂单独或协同使用对回收率的影响，并对净化剂和无水MgSO4的用量进行了优化，从净化液的澄清度上看，PSA+C18+GCB 的净化效果最好，溶液状态接近无色透明，PSA+C18混合使用的净化效果也要优于三种净化剂单独使用（图5）；但从回收率上看，由于GCB 对于平面结构的真菌毒素具有较高的亲和力，它的加入使目标物的回收率明显下降（图6），这一现象也与Zhao 等[20]的研究结果相似，在该研究中其经过筛选后选择了单一的C18作为净化剂。杂质相对较少的样品更有利于对色谱柱和仪器的保护，综合考虑，本实验选择PSA+C18+无水MgSO4作为净化剂组合。

图5 不同吸附剂对砂仁基质的净化效果Fig.5 Purifying effect of different adsorbents on Amomum villosum

图6 不同吸附剂对4 种黄曲霉毒素回收率的影响Fig.6 Effect of adsorbents on recovery of 4 aflatoxins

图7 吸附剂用量对4 种黄曲霉毒素回收率的影响Fig.7 Effect of the amount of sorbents on recovery of 4 aflatoxins

在QuEChERS 净化技术的应用中，吸附剂的用量对基质杂质的去除和目标化合物的回收有着至关重要的作用，过量吸附剂的使用会导致部分目标物被吸附除去，吸附剂剂量使用的不足会导致除杂效果不佳，两种情况皆会影响方法的灵敏度及目标化合物的响应值。本实验前期比较了不同用量（50、100、150、200 mg）的C18、PSA（1:1）组合的净化效果，结果发现C18、PSA（1:1）的用量为150 mg 时目标物的整体回收率最高，达到了72.09%～91.13%，因此通过选取两种净化剂120、150、180 mg 三个水平下的用量组合，进行优化配比，并加以比较了C18、PSA（1:2）和（2:1）的净化效果。净化剂用量对黄曲霉毒素的回收率结果见图5，两种净化剂用量为180 mg C18+150 mg PSA时4 种毒素的整体回收率最高，达到了77.75%～98.49%，因而选择此配比为净化剂最佳用量，同时实验过程中发现加入无水MgSO4能普遍提高目标毒素的回收率，可以解释为盐的除水作用能使目标物往有机层移动，从而尽可能地使其充分溶解于乙腈。综合净化剂种类及其用量的探究结果，本研究确定以“180 mg C18+150 mg PSA+300 mg 无水MgSO4”为最佳净化剂组合，此组合下目标物的回收率达到了94.12%～110.49%。无独有偶，姚誉阳等[12]对该4 种毒素的净化提取同样使用了该净化剂组合，但用量不同，其用量为75 mg C18+50 mg PSA+200 mg 无水MgSO4，与本实验相比较少，这与样品基质相关，基于砂仁基质的复杂性，该净化剂组合的确定，对于精准测定4种毒素尤为重要。

2.5 线性范围、检出限、定量限和基质效应

在液质联用技术的分析过程中，目标化合物的检测结果会被样品基质中的某些物质所干扰，这种现象被称作基质效应（Matrix Effect，ME）[30]，对于基质效应，采用ME=K1/K2（K1：基质标准曲线的斜率，K2：溶剂标准曲线的斜率）评估[31]：若ME 在0.8～1.2之间，基质效应可忽略不计，ME 值低于或高于该范围则表明存在基质抑制或增强现象。经分析表明，4 种毒素的基质效应在0.46～0.67 的范围内，表明该方法存在基质抑制情况，同位素内标法与空白基质外标法常被用于改善基质抑制情况，考虑到检测机构的成本及分析时间等因素，本实验采用后者进行定量实验以补偿基质效应。

配制空白基质标准工作液（0.20～10.00 μg/L，6 个质量浓度点），上机测定。以目标物定量离子的峰面积为纵坐标（y）与对相应的质量浓度为横坐标（x，μg/L）作图，绘制4 种黄曲霉毒素的基质标准曲线，求出线性方程和相关系数，仪器的检出限（LOD，S/N≥3）和定量限（LOQ，S/N≥10）通过信噪比（S/N）来确定。结果表明，4 种黄曲霉毒素在0.20～10.00 μg/L的质量浓度范围内，峰面积与其对应质量浓度展现出良好的线性关系，相关系数（R2）均大于0.998 9，方法检出限在0.30～0.60 μg/kg 之间，方法定量限在1.00～2.00 μg/kg 之间，其中AFB1、AFB2 的检出限和定量限与米粉[12]、白露片[32]基质中的报道值相同，AFG1 的检出限和定量限低于槟榔[33]基质的报道值，AFG2 的检出限和定量限低于玉米[34]基质中的报道值，由此可知，本方法的定性和定量分析能力良好。

2.6 方法回收率和精密度

通过分析在定量限水平下加标的空白砂仁样品，评估该方法的回收率与精密度。分别按照低（1×LOQ）、中（2×LOQ）、高（10×LOQ）3 个质量浓度水平加入适量4 种黄曲霉毒素混合标准工作液，每个浓度做6 个平行样品，上机测定，计算加标回收率（Recovery）、日内精密度（Intra-RSD）和日间精密度（Inter-RSD）。结果表明，在砂仁基质中，各目标化合物在低水平添加量下的平均回收率为89.50%～107.70%，日内精密度为3.04%～6.71%，日间精密度为4.16%～6.20%；在中水平添加量下的平均回收率为99.17%～113.12%，日内精密度为3.01%～4.87%，日间精密度为3.73%～4.66%；在高水平添加量下的平均回收率为101.60%～105.31%，日内精密度为1.31%～2.32%，日间精密度为1.29%～3.11%（表4），证明此方法具有较高的可重复性与准确度，可满足砂仁食品中4 种黄曲霉毒素的定量分析要求。

表4 实际空白样品4 种黄曲霉毒素的加标回收率和相对标准偏差（n=6）Table 4 Spiked recoveries and RSDs of 4 aflatoxins in real blank samples (n=6)

2.7 实际样品的测定

应用本方法对广州市售的15 批砂仁样品进行定量分析，均未检测出阳性样品。从检测结果上分析，广州市售砂仁的黄曲霉毒素污染情况并不严重，但参考学者现有的研究及实际样品的检测结果[35,36]，随着各地气候的差异及储藏时间的延长，砂仁中仍存在黄曲霉毒素污染的风险，该方法对于其污染情况的日常筛查具有重要意义。

3 结论

本文建立了QuEChERS-超高效液相色谱串联质谱法同时检测砂仁中4 种黄曲霉毒素的测定方法，该方法前处理过程简便、灵敏度高、复现性强。通过对不同流动相、色谱柱、提取条件及净化条件进行优化，确定最佳实验条件，经ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱分离后4 种黄曲霉毒素得到良好分离；采用1%甲酸-乙腈提取、QuEChERS 盐析和净化以获得良好的除杂效果及回收率。与现有文献相比，本文首次将超高效液相色谱串联质谱法应用于砂仁基质中黄曲霉毒素的检测，该方法可满足政府监管部门对砂仁中4 种黄曲霉毒素快速筛查，有望在日常风险监测中得到良好的应用，具有一定的实际意义。