壮骨止痛胶囊对去卵巢致骨质疏松大鼠肠道微生态的影响

张天慧，刘 婷，雷晓明，王 舒，王丰林，刘平安*，张国民*

湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis,PMOP）是一种常发生于女性绝经后5～10 年内的骨科疾病，由于卵巢功能的下降，雌激素大幅度下降，导致成骨细胞和破骨细胞的动态平衡受到影响，继而结构和功能发生紊乱，表现为骨痛、易骨折[1]。 目前，临床中采取的药物治疗，长期服用易产生耐药性和许多不良反应，因此，亟须寻找更加安全可靠的治疗方式[2]。 中医药优势在于资源丰富、药效理想、不良反应少，可通过调控骨代谢相关信号通路及骨骼相关细胞的增殖分化等来治疗骨代谢紊乱导致的PMOP，进而维护骨骼健康[3]。 越来越多的研究表明，中医药对骨代谢的调控作用可能与肠道菌群有关，但其具体机制仍需进一步探讨[4]。 因此，本研究以去卵巢（ovariectomised, OVX）大鼠为研究对象，探索壮骨止痛胶囊（Zhuanggu Zhitong Capsule, ZGZTC）对OVX 所致骨质疏松症（osteoporosis, OP）大鼠肠道菌群结构与多样性的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

2 月龄SPF 级SD 雌性大鼠40 只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[许可证号：SCXK（湘）2019-0009]，于湖南中医药大学动物实验中心饲养，选用无菌颗粒饲料饲养，自由饮水，环境温度20～25 ℃，室内通风良好。适应性喂养1 周后进行实验。操作均符合实验动物伦理学要求，并通过湖南中医药大学实验动物中心伦理审查（伦理号：LL2022110903）。

1.2 主要试剂和仪器

ZGZTC 由补骨脂、淫羊藿、枸杞子、女贞子、骨碎补（烫）、狗脊、川牛膝组成（0.45 g/粒，四川美大康药业股份有限公司，国药准字：Z20050118，批号：220703）；戊酸雌二醇（estradiol valerate, EV）片（1 mg/片，拜耳医药保健有限公司广州分公司，国药准字：J20171038，批号：699A）；脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、白细胞介素-17（interleukin-17, IL-17）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）ELISA 试剂盒（厦门仑昌硕生物科技有限公司，批号：YD-31044、YD-30201、YD-31073）；大鼠GAPDH内参引物（生工生物工程股份有限公司，批号：IB08KA7169）。

多功能酶标仪（奥地利TECAN 公司，型号：1811004222）；荧光定量PCR 仪（瑞士Roche 公司，型号：LightCycler480 Ⅱ）；显微镜（德国Zeiss 公司，型号：Axioscope 5）。

1.3 分组及给药

将实验动物随机分为造模组（30 只）、假手术（SHAM）组（10 只）。 造模组采用国内外公认的去除雌性大鼠双侧卵巢方法建立PMOP 病理模型[5-7]，即经腹腔注射1%戊巴比妥钠（0.03 g/kg）麻醉后，将大鼠置于俯卧位，备皮消毒，背侧正中旁1～2 cm 行纵切口打开腹腔，找到卵巢，结扎摘除该侧卵巢组织后，逐层缝合切口，同法处理对侧卵巢，SHAM 组仅摘除卵巢周围等质量脂肪组织，术后注射青霉素。 1周后，将造模组随机分为OVX 组、ZGZTC 组、EV组，每组10 只。 4 组大鼠均灌胃，ZGZTC 组灌服ZGZTC混悬液[1.944 g/（kg·d）][8]，EV 组灌服EV 混悬液[0.09 mg/（kg·d）][9]，SHAM 组、OVX 组灌服等体积生理盐水，连续灌胃12 周后处死并取材。

1.4 HE 染色

取左侧股骨及一部分结肠用于HE 染色，检测股骨、结肠病理形态学变化。 取固定的结肠、脱钙后的股骨组织标本，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明，浸入石蜡中包埋，包埋完全后切片，厚度约5 μm，切片脱蜡、水化，先后用苏木素、伊红染色，脱水透明后采用中性树胶封片，光镜下观察并拍照。

1.5 ELISA 法检测血清IL-17、TGF-β、LPS 表达

大鼠腹主动脉取血，将血液样本置于4 ℃冰箱过夜，待充分凝固后，4 ℃，3 000 r/min 离心15 min（离心半径17.8 cm），取上清液。 按照双抗体夹心法对大鼠血清IL-17、TGF-β、LPS 进行ELISA 检测，使用多功能酶标仪检测450 nm 波长处的OD 值，计算浓度。

1.6 RT-PCR 法检测结肠Occludin、ZO-1 mRNA表达量

取适量结肠组织，使用超纯总RNA 提取试剂盒提取RNA，核酸蛋白浓度测定仪测量RNA 浓度。逆转录成cDNA 后行两步法扩增PCR（95 ℃反应1 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火1 min，循环45 次）。 依据原始检测结果，运用2-ΔΔCt法计算咬合蛋白（Occludin）、闭合小环蛋白-1（zonula occludens-1, ZO-1）mRNA 相对表达量。 引物目的基因序列搜索于美国国家生物技术信息中心，设计、合成于生工生物工程股份有限公司，引物序列见表1。

表1 引物序列表

1.7 16S rRNA 测序检测大鼠肠道菌群

取新鲜大鼠粪便，提取DNA 后进行16S rRNA高通量测序。 采用细菌通用引物扩增16S 的V3-V4区，扩增产物经过纯化和质检后通过Illumina Miseq平台进行测序。

1.8 统计学分析

本实验数据采用Graphpad Prism 8.0 统计软件进行统计分析。 计量资料以“±s”表示，对符合正态分布的数据，组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD 检验（方差齐时）或Dunnnett's T3检验（方差不齐时）；若不符合正态分布，组间比较采用秩和检验（Kruskal-Wallis）。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠股骨、结肠HE 染色结果

SHAM 组大鼠股骨组织骨小梁结构完整、分布均匀，骨髓腔大小无异常。与SHAM 组比较，OVX 组股骨的骨小梁网状结构破坏，骨小梁数目减少，骨小梁部分出现断裂，脂肪空泡形成增多。 与OVX 组比较，ZGZTC 组、EV 组骨小梁数目增加，脂肪细胞形成的空泡减少。 详见图1。

图1 各组大鼠股骨微结构情况（HE，×100）

SHAM 组结肠形态正常，杯状细胞和隐窝细胞数量较多，腺体分布整齐，炎症细胞浸润及渗出程度低。OVX 组上皮细胞的形态被破坏并且炎性细胞浸润。与OVX 组相比，EV 组杯状细胞有所增多，炎症细胞浸润减少；ZGZTC 组见正常杯状细胞和U 型隐窝，腺体排列整齐，炎症细胞浸润显著变少。 详见图2。

图2 各组大鼠结肠微结构情况（HE，×200）

2.2 各组大鼠结肠Occludin、ZO-1 mRNA 相对表达量比较

与SHAM 组比较，OVX 组大鼠结肠组织Occludin、ZO-1 mRNA 相对表达量明显降低（P<0.01）；与OVX 组比较，ZGZTC 组和EV 组大鼠结肠组织Occludin、ZO-1 mRNA 相对表达量明显升高（P<0.01）。详见图3。

图3 各组大鼠结肠Occludin、ZO-1 mRNA 表达情况（n=10）

2.3 各组大鼠血清IL-17、TGF-β、LPS 值比较

与SHAM 组比较，OVX 组血清IL-17、LPS 值升高（P<0.01），TGF-β 值降低（P<0.01）；与OVX 组比较，ZGZTC 组和EV 组血清IL-17、LPS 值均降低（P<0.01），TGF-β 值升高（P<0.01）；ZGZTC 组和EV组IL-17、TGF-β、LPS 值差异均无统计学意义（P>0.05）。详见图4。

图4 各组大鼠血清中IL-17、TGF-β、LPS 含量（n=10）

2.4 各组大鼠16S rRNA 测序结果

2.4.1 肠道菌群测序有效特征序列分析 3组大鼠共分析得到OTU 物种1 618 个，OVX 组、ZGZTC 组和EV 组各有888、803、801 条，其中，3 组共有物种数目252 个，特有的特征数分别有356、318、322 条。 详见图5。

图5 特征分布韦恩图

2.4.2 肠道菌群α 多样性分析 各组大鼠肠道菌群的稀释曲线最终都趋于平缓，表明各组测序获得的特征数量合理，物种丰富度足够，测序深度满足后续数据分析（图6）。 此外，各组大鼠肠道菌群的丰富度指数（潮1 指数与Ace 指数）、多样性指数（辛普森指数与香浓指数）均无显著性差异（图7）。

图6 α 多样性指数稀释曲线

图7 α 多样性分析指数比较

2.4.3 肠道菌群β 多样性分析 通过主坐标分析（principal coordinate analysis, PCoA）和聚类分析来分析β 多样性的差异。 PCoA 结果显示，各组样品显著分离，置换多元方差分析表明组间差异具有显著性（P=0.006<0.01），聚类分析也显示出类似的结果。详见图8。

图8 β 多样性分析比较

2.4.4 各组大鼠肠道菌群结构丰度分析

（1）门水平菌群丰度及差异

由图9-A 可知，相对丰度最高的10 个菌群分别为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、脱硫菌门（Desulfobacterota）、弯曲菌门（Campilobacterota）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、螺旋菌门（Spirochaetota）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、狄氏副拟杆菌（Patescibacteria），其中，厚壁菌门和拟杆菌门为肠道的优势菌群，相对丰度占比80%以上。 在厚壁菌门丰度比较中，相比于OVX 组（69.53%），ZGZTC 组（67.96%）和EV 组（61.16%）的相对丰度均下降。 在拟杆菌门丰度比较中，相比于OVX 组（21.94%），ZGZTC 组（25.16%）和EV 组（30.09%）的相对丰度均增加。

图9 门水平（A）及属水平（B）的肠道菌群相对丰度

（2）属水平菌群丰度及差异

由图9-B 可知，相对丰度前10 的菌属有毛螺菌科＿NK4A136 菌属（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、普氏菌属（Prevotella）、龙布茨氏菌属（Romboutsia）、全缘球菌属（Alloprevotella）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、罗斯氏菌属（Roseburia）、疣微菌属（Turicibacter）、普雷沃氏菌科＿Ga6A1 菌属（Prevotellaceae_Ga6A1_group）、优杆菌科＿ 惰性菌属（[Eubacterium]_siraeum_group）、优杆菌科＿ 反刍菌属（[Eubacterium]_ruminantium_group）。 在毛螺菌科＿NK4A136 菌属丰度比较中，相比于OVX 组（14.23%），ZGZTC 组（6.10%）丰度明显降低，而EV 组（18.17%）相较于OVX 组丰度增加；在普氏菌属比较中，对比于OVX 组（8.36%），ZGZTC 组（4.71%）的相对丰度明显降低，而EV 组（8.71%）相较于ZGZTC 组的相对丰度增加；在龙布茨氏菌属比较中，相比于OVX组（1.68%），ZGZTC 组（11.03%）的相对丰度显著增加，而EV 组（1.55%）相较于ZGZTC 组的相对丰度下降。

3 讨论

中医古籍并无PMOP 的记载，但其临床表现与“骨痿”相似[10]。“骨痿”以肝肾阴虚证、脾肾阳虚证及肾虚血瘀证多见，故治疗多从先后天之本——脾肾入手[11]。 ZGZTC 作为治疗OP 的良药之一，具有补益肝肾、壮骨止痛之效。 方中君药补骨脂可温肾壮阳，臣药淫羊藿可强筋壮骨，二药共奏助生肝肾之阳之功；枸杞子、女贞子滋补肝肾，骨碎补活血通经，狗脊补肝肾、强腰膝，四者共助补下焦肝肾之阴、强筋壮骨之功，共为佐药；使药牛膝则引药下行达病所[12]。然而，基于肠道菌群探讨ZGZTC 防治PMOP 的相关机制尚未阐明，有待进一步验证。

PMOP 的发病核心是骨代谢失衡，而导致骨代谢失衡的原因有炎症高表达、免疫系统失衡、雌激素水平降低，过程中均有肠道菌群参与。 MCCABE 等[13]发现，肠道炎症可导致OP 发生，其中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和IL-17 等炎症因子可刺激破骨细胞形成。MA 等[14]发现，OVX 大鼠闭合蛋白-1（Claudin-1）和Occludin 表达降低，提示PMOP 会破坏肠道屏障功能，而肠道菌群可能通过激活免疫细胞来调节Claudin-1 和Occludin 蛋白表达。随着绝经后雌激素水平逐渐降低，甲状旁腺素分泌逐渐增多，但肠道菌群主要代谢产物短链脂肪酸的产生可以降低甲状旁腺素水平，从而增加矿物质吸收，影响激素代谢[15]。EV 可提高体内的雌激素水平，具有抗骨质疏松作用。 临床上将EV 和淫羊藿总黄酮合用，淫羊藿的雄激素样作用可抵抗雌激素的毒副作用，从而起到平补阴阳、益肾健骨的疗效[16]。 健骨颗粒对肠道菌群环境和骨免疫调节有影响，可通过肠道菌群-短链脂肪酸-调节性T 细胞（regulatory T cell, Treg）/辅助性T细胞17（T helper cell 17, Th 17）轴调节骨代谢[17]。 亦有研究表明，肠道中的有益菌群可通过调节肠道微生物群的组成和功能来影响Treg/Th17 细胞及其相关细胞因子IL-17、TGF-β 之间的平衡以维持骨骼稳态[18]。因此，本实验检测了各组血清炎症标志物水平，结果显示，与SHAM 组相比，OVX 组大鼠IL-17 明显升高、TGF-β 降低，肠道黏膜存在大量炎性细胞，紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin 表达均降低。 与OVX 组比较，ZGZTC 组及EV 组IL-17 明显降低、TGF-β 升高，肠道炎症情况明显改善。 因此，减少炎症因子的产生，增加益生菌含量可能是ZGZTC 通过肠道菌群改善PMOP 的机制之一。

肠道厚壁菌门-乳杆菌属的减少与老年阶段常见疾病之间存在密切相关性[19]。研究显示，与骨密度正常的受试者相比，OP 患者的肠道菌群在门的水平上，厚壁菌门显著增加，而拟杆菌门显著减少，厚壁菌门/拟杆菌门与腰椎骨密度呈负相关；在属的水平上，OP 患者肠道菌群中梭菌属、粪球菌属、乳酸杆菌属的相对丰度显著增加，韦荣氏球菌属的相对丰度显著下降[20]。本研究通过对比肠道菌群门、属丰度发现，门水平上，相比于OVX 组，ZGZTC 组与EV 组厚壁菌门丰度减少，拟杆菌门丰度上升，而此菌在帮助宿主维持肠道微生态平衡方面起到相当重要的作用，同时可通过与雌激素之间的相互作用有效调节骨代谢[21]，说明ZGZTC 可能通过改善OVX 大鼠肠道菌群中厚壁菌门/拟杆菌门的比例，改善由OVX所致的肠道菌群紊乱状态。 在属的水平上，ZGZTC能逆转瘤胃球菌属优势菌属在OVX 大鼠肠道菌群中的丰度减少的情况，减少OVX 组致病菌属的存在，进一步防止LPS 分泌增加及肠黏膜屏障破坏。毛螺菌科是体内的有害菌，与体质量及血清总胆固醇含量呈正相关，提示其与骨-脂代谢的调节密切相关[22]。本实验结果显示，ZGZTC 组毛螺菌科丰度降低，提示ZGZTC 可能通过肠道菌群及其代谢产物进行骨-脂代谢调节，从而发挥抗PMOP 作用。

综上所述，ZGZTC 能够通过调节肠道菌群结构、减少炎症因子生成、改善肠道炎症等方式调节OVX 大鼠骨的形态学变化。 本实验为ZGZTC 治疗OVX 提供了一定的科学依据，并且证实了其作用机制与调节肠道微生态有关，为补肾类方药通过调节肠道微生态改善疾病提供了研究基础。 但本研究只采用了16S rRNA 进行测序，存在覆盖不足等缺陷，后续将进行更深入的生物信息学分析，并对涉及的相关信号通路行进一步实验研究。