基于网络药理学和实验验证探讨近视复明丸治疗近视的作用机制

黄 云，陈 姝，夏如梅，李 蕾，喻干龙，喻 娟*

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.中医药防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学第一中医临床学院，湖南 长沙 410007

近视是一种全球普遍存在的视觉疾病，主要表现为远距离视物不清，近距离视物良好，并逐渐出现飞蚊症、闪光感等症状，后期近视进展为高度近视或者病理性近视，则容易合并多种眼部疾病，例如白内障、青光眼、黄斑变性和视网膜脱离等，这些均可造成视力的严重丧失[1]。 近视已成为我国及全世界的严重公共卫生问题，预计2050 年，全球近视患病人数将会达到47 亿[2]。研究发现，2020 年，我国儿童青少年近视率为52.7%，其中，小学生35.6%、初中生71.1%、高中生达80.5%[3]。近视高发病率严重影响青少年的视觉健康。 目前，临床上对近视的治疗以框架眼镜、角膜塑形镜或低浓度阿托品滴眼液为主，同时也有耳穴贴压及针刺等治疗[4]，但各类方法疗效并不明确，且均有一定局限性。

中医药防控近视具有独特优势[5]。 近视在中医古籍中被称为“目不能视”“能近怯远症”[6]。 《诸病源候论·目病诸候》[7]中认为，本病为“劳伤肝腑，肝气不足，兼受风邪，使精华之气衰弱，故不能远视”。 近视复明丸由芍药、柴胡、木瓜、丹参、当归、人参、巴戟天、石菖蒲、黄芪组成，近视复明丸作为院内制剂，是喻干龙教授根据青少年近视防治的长期临床经验组方而成。 肝气郁结而致血循不畅，肝郁则脾失健运，气血生化无源，气血无以上乘，目系则失其濡养。 柴胡疏肝理气开郁；芍药、木瓜味酸以敛肝；人参、黄芪健脾胃以补中气；石菖蒲豁痰开窍；丹参、当归补血活血；巴戟天温肾以升举阳气，濡养目窍。 近视复明丸在湖南中医药大学第一附属医院应用于近视治疗已有20 余年，临床疗效较好，但其中药复方的作用机制及靶点仍不明确。 本研究以近视复明丸治疗近视的有效成分和靶点为切入点，研究其作用机制，为近视复明丸的临床应用提供进一步的理论支持。

1 方法

1.1 近视复明丸活性成分及靶点的获取

本研究采用TCMSP 数据库及TCMID 数据库收集近视复明丸中芍药、柴胡、木瓜、丹参、当归、人参、巴戟天、石菖蒲、黄芪的化学成分，并设置口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%，类药性（druglikeness, DL）≥0.18，对其活性成分进行鉴定，最终将数据导入药物靶点预测系统SwissTargetPrediction，进行靶点预测。

1.2 近视相关靶点的获取与筛选

以“myopia”为检索词，在GeneCards、DrugBank、OMIM 和Therapeutic Target Database 数据库进行检索与筛选，最终得到近视的相关靶点。

1.3 “药物-疾病”网络模型的构建与分析

将近视复明丸药物成分靶点与近视相关靶点导入Venny 2.1.0 数据库，所得交集靶点，即为近视复明丸治疗近视的潜在作用靶点。

1.4 “成分-靶点”网络的构建与分析

将近视复明丸药物成分靶点与近视靶点的交集靶点，共同导入Cytoscape 3.9.1 软件，构建“成分-靶点”可视化网络图，同时分析网络拓扑属性，度值表示成分所涉及的靶点个数，度值越大，说明该成分对疾病治疗作用越大。 本研究利用网络模型下活性成分的度值，对近视复明丸治疗近视的主要活性成分进行分析。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络构建

将近视复明丸与近视的交集靶点导入STRING平台，构建PPI 网络图。 将筛选的结果通过Cytoscape 3.9.1 软件进行拓扑学分析，筛选近视复明丸治疗近视的关键节点。

1.6 近视复明丸治疗近视相关靶点的GO 和KEGG富集分析

将近视复明丸与近视的共同靶点导入DAVID 6.8 数据库，进行可视化分析。

2 动物实验验证

2.1 实验动物

选取约3 周龄雄性普通级健康豚鼠48 只，体质量160～200 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物质量许可证：SCXK（湘）2019-0015；实验动物在实验前均通过裂隙灯排除眼睑异常、眼底等病变。 饲养条件：室温保持在25 ℃左右，空气湿度保持在45%～50%，昼夜交替饲养（12 h 交替光照），自由饮食，每日进食新鲜蔬菜以补充体内维生素C，适应性饲养1 周后开始实验。 实验由湖南中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会审核批准（伦理编号：ZYFY20220813-09）。

刀手、剑士全聚集在练功厅，武成龙在上首道：“大伙集中于此是由于黑旗会闯进本庄之前三少吩咐我告诉大伙：本庄不幸成为江湖铁血组合，组合应有组合的铁律，三少会在不同时期有不同要求。虽然无法确定要求证确，但即使有误也要无条件遵守。因为三少为家园而战，由于家园危如悬卵，任何人违背三少意志三少都不会轻饶。也在那时我知道琴台之战是三少制造的第一悬案，也蓦然悟及铁卫中有一些熟悉的面孔是由于我们数年天涯亡命，那些铁卫又放下了昔日的名声。”

2.2 主要仪器与试剂

研磨仪（型号：KZ-II，武汉塞维尔生物科技有限公司）；冷冻离心机（型号：neofuge 15R，力新仪器上海有限公司）；电泳仪（型号：DYY-6D，北京六一生物科技有限公司）；荧光定量PCR 仪（型号：ABI QuantStudio 1，美国Thermo 公司）；逆转录仪（型号：SCI1000-G，美国SCILOGE 公司）；曝光仪（型号：HB-980，美国Protein simple 公司）；纯水仪（型号：AJC-0501-P，重庆艾科浦有限公司）。 Trizol（批号：R1100，北京索莱宝科技有限公司）。 近视复明丸（生产批号：20220817，湖南中医药大学第一附属医院）。复方托吡卡胺滴眼液[生产批号：MP2262，参天制药（中国）有限公司]。

2.3 分组、造模及给药

随机将豚鼠分为空白组、近视模型组、中药高剂量组、中药低剂量组，共4 组，每组12 只。 近视模型组、中药高剂量组和中药低剂量组豚鼠用半球形塑料眼罩遮盖右眼4 周，诱导形觉剥夺性近视动物模型[8-9]，左眼不做处理；空白组不做任何处理。 4 周后经检影验光确认造模成功[10]。 继续保持造模状态4周。 根据“人和动物按体表面积折算的等效剂量比值”折算等效剂量[11]。 予近视模型组2 mL 生理盐水灌胃；中药高剂量组予2 mL 近视复明丸药粉（给药浓度为0.8 g/mL）灌胃；中药低剂量组予2 mL 近视复明丸药粉（给药浓度为0.2 g/mL）灌胃。 空白组予2 mL 生理盐水灌胃。 每日1 次，连续灌胃4 周。

2.4 屈光度测量

在实验造模前和造模4 周后测量所有豚鼠屈光度，将豚鼠置于暗室，使用复方托吡卡胺滴眼液滴入豚鼠右眼结膜囊中，每5 min 滴1 次，充分散大瞳孔，验光师在30 min 后进行带状光检影镜检影验光检测屈光度。

2.5 巩膜组织病理学形态观察

每组取3 只豚鼠，经处死拆除眼球后，选取巩膜组织固定在多聚甲醛溶液中，常规脱水、石蜡包埋，选取靠近视盘部切片，染色，显微镜下观察各组巩膜厚度及各层间结构。

2.6 实时荧光定量PCR

每组各取3 只豚鼠，取右眼眼球，分离巩膜组织，采用Trizol 法提取巩膜组织总RNA，参考试剂盒说明书进行操作，逆转录合成cDNA，引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成。 MMP-2 上游引物：5'-ACACACCTGATCTGGACCCT-3'；下游引物：5'-ACACAGATGTGCAGCGAAGA-3'；产物大小为93 bp。 TIMP-2 上游引物：5'-ACACAGATGTGCAGCGAAGA-3'；下游引物：5'-AACTACGAGGGCAACTGAGC-3'；产物大小162 bp。 调整反应程序，执行扩增，先在94 ℃预变性2 min，94 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃60 s，共循环45 次。最后以β-actin 作为内参，用2-△△Ct方法进行分析。

2.7 统计学分析

统计学分析采用GraphPad Prism 8 软件，计量资料采用“±s”表示，组间比较用Tukey 的多重比较检验分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 近视复明丸活性成分与靶点

经TCMSP 和TCMID 数据库检索，共收集到587个OB≥30%且DL≥0.18 的有效活性成分，其中芍药123 种、柴胡74 种、木瓜123 种、丹参52 种、当归35 种、人参51 种、巴戟天26 种、石菖蒲42 种、黄芪61 种。 采用SwissTargetPrediction，将上述数据进行靶点预测，经合并，筛除重复值后共得到近视复明丸作用靶点176 个。

3.2 近视相关作用靶点

利用GeneCards 数据库、Therapeutic Target Database 数据库、DrugBank 数据库和OMIM 数据库，以“myopia”为检索词，分别检索到4 888、2、270、26个与近视相关的靶点，移除重复值后得到4 217 个近视相关作用靶点。

3.3 “成分-靶点”网络的构建与分析

图1 近视复明丸与近视共同靶点

图2 中药-有效成分-靶点网络

3.4 PPI 网络的构建及核心靶点的筛选

通过STRING 平台与Cytoscape 3.9.1 软件生成PPI 网络，图中共有122 个节点，1 996 条边。节点的颜色和面积越深、越大，其节点度值越大。 结果显示，丝氨酸-苏氨酸激酶（serine-threonine kinase 1, AKT1）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A, VEGFA）、白细胞介素-1β（interlukin-1β, IL-1β）、基质金属蛋白酶抑制剂-9（matrix metallo proteinase-9, MMP-9）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）等的度值排名靠前，推断这些靶点是近视复明丸治疗近视的核心靶点。 详见图3。

图3 近视复明丸与近视PPI 网络

3.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析

通过对DAVID 数据库GO 功能分析，共得到631条目，其中472 条生物过程（biological process, BP）、57 个细胞组成（cell composition, CC）、102 个分子功能（molecular function, MF），选取前10 项进行可视化，并使用在线作图工具绘制出GO 富集分析条形图。 详见图4。 其中，BP 主要包括蛋白质结合、相同的蛋白质结合、酶结合、转录因子活性等；CC 主要包括细胞核、细胞质、核浆、细胞膜的组成部分、细胞外空间等；MF 主要包括RNA 聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、正调控转录、DNA 的正向调控等。 通过KEGG 富集通路分析，共获得151 条细胞信号通路，通路主要涉及磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B, Akt）信号通路信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）信号通路、白细胞介素-17（interleukin-17, IL-17）信号通路等。 选择前20 条通路作为近视复明丸治疗近视的重要途径进行分析。 详见图5。

图4 关键靶点的GO 分析

图5 核心靶点的KEGG 富集分析

3.6 各种豚鼠造模前后屈光度比较

造模前，各组豚鼠屈光度差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。 造模4 周后，与空白组比较，近视模型组、中药高剂量组和中药低剂量组屈光度降低，差异有统计学意义（P＜0.01），结果提示造模成功。 详见表1。

表1 造模前后各组豚鼠屈光度比较（±s，n=12，D）

表1 造模前后各组豚鼠屈光度比较（±s，n=12，D）

注：与空白组比较，##P＜0.01。

组别空白组近视模型组中药高剂量组中药低剂量组造模前2.90±0.31 2.83±0.40 2.98±0.27 3.13±0.25造模后1.21±0.23-1.27±0.31##-1.15±0.29##-1.10±0.27##

3.7 近视复明丸对各组巩膜厚度的影响

空白组豚鼠的巩膜组织形态完整，胶原纤维结构紧密，细胞排列整齐，分布规则；近视模型组巩膜厚度较空白组变薄，且胶原纤维结构疏松，排列紊乱；中药高剂量组与中药低剂量组巩膜厚度较模型组均增加；中药高剂量组胶原纤维排列较模型组稍紧密，各层结构较中药低剂量组清晰。 与空白组比较，近视模型组显著变薄（P＜0.01）；与近视模型组比较，中药低剂量组、中药高剂量组厚度显著增加（P＜0.05，P＜0.01）。 详见表2，图6。

表2 各组豚鼠巩膜厚度比较（±s，n=3）

表2 各组豚鼠巩膜厚度比较（±s，n=3）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与近视模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别空白组近视模型组中药高剂量组中药低剂量组巩膜厚度/μm 346.23±5.38 319.33±7.32##341.10±3.04**336.00±1.55*

图6 各组豚鼠巩膜组织HE 染色图（×200）

3.8 近视复明丸对巩膜组织中MMP-2 及基质金属蛋白酶抑制剂-2（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2, TIMP-2）mRNA 表达的影响

与空白组比较，近视模型组豚鼠巩膜组织中MMP-2 mRNA 表达水平显著增加（P＜0.01）、TIMP-2 mRNA 表达水平显著降低（P＜0.01）；与近视模型组相比较，中药高剂量组中豚鼠巩膜组织MMP-2 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.01）、TIMP-2 mRNA 表达水平明显增加（P＜0.05）；与中药高剂量组相比较，中药低剂量组巩膜组织中MMP-2 mRNA表达水平明显降低（P＜0.01）。 详见表3。

表3 近视复明丸对巩膜组织中MMP-2 及TIMP-2 mRNA表达的影响（±s，n=3）

表3 近视复明丸对巩膜组织中MMP-2 及TIMP-2 mRNA表达的影响（±s，n=3）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与近视模型组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；与中药高剂量组比较，&&P＜0.01。

组别空白组近视模型组中药高剂量组中药低剂量组MMP-2 1.000±0.089 1.337±0.061##0.763±0.026**0.057±0.005**&&TIMP-2 1.000±0.09 0.272±0.018##0.709±0.037*0.142±0.003

4 讨论

从药物-疾病交集靶点可知，近视复明丸可作用于AKT1、VEGFA、IL-1β、MMP-9、EGFR、MMP-2 等多个靶点，从而起到治疗近视作用。 在近视复明丸治疗近视过程中，发挥关键作用的途径主要包括PI3K/Akt信号通路、MAPK 信号通路、TNF 信号通路等。

Akt 可调节多种生物过程，它在调节细胞生存、增殖和凋亡中发挥重要作用[12]。 其中的亚型AKT1，在调节胚胎发育，生长及存活上有着独特的优势作用[13]。HUANG 等[14]研究发现，AKT1 通过在小胶质细胞和巨噬细胞发生的极化作用，影响视神经病变的病程变化。表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）是作用在机体内外各种组织细胞上的生长因子， 可通过促进巩膜成纤维细胞的增殖，进而影响巩膜的重塑[15]。 而EGFR 可参与调节巩膜成纤维细胞的增殖和分化[16]。 EGR 与EGFR 结合，对体内外的组织生长与增殖起着明显的调节作用[17]。

基因金属蛋白酶是一类能够降解细胞外基质（extracellular matrix, ECM）并参与巩膜重塑的内肽酶[18-19]，其家族成员MMP-2 与巩膜ECM 重塑关系最为密切[20]。在近视的发展过程中，巩膜重塑在其中起到关键调控作用，而巩膜重塑的关键在于MMP-2及其抑制物TIMP-2 之间的动态平衡[21]。 LIU 等[22]研究发现，在形觉剥夺诱导近视树鼩中发现MMP-2 表达水平增高，而TIMP-2 表达水平降低。 QIAN 等[23]研究发现，在近视豚鼠巩膜中，吡仑西平降低了MMP-2 的表达，增加了组织抑制物TIMP-2 的表达，这提示MMP-2 与TIMP-2 的动态平衡在近视中发挥着重要作用。

PI3K/Akt 信号通路对多种眼病有着重要的调节作用[24]，该通路有多种下游信号通路，包括糖原合成酶激酶3 和凋亡信号调控激酶1 等[25]，PI3K 通过催化方式生成产物，进而激活丝裂原活化蛋白激酶等蛋白，进而参与多种近视相关的生物过程，其中包括巩膜重塑[26]。研究显示，玻璃体内miR-200a 紊乱，原因是PI3K/Akt 信号通路影响眼轴长度的发展[27]。这也进一步说明，PI3K/Akt 信号通路可以抑制近视的进展。

本研究在网络药理学的基础上进行实验验证。结果显示，与近视模型组比较，近视复明丸使MMP-2 mRNA 表达水平下降，TIMP-2 mRNA 表达水平增加，促进巩膜胶原纤维的合成，减少巩膜胶原纤维的降解，进而调控巩膜重塑，延缓近视进展。 本研究为近视复明丸的临床应用提供了科学依据，同时为后续近视复明丸的相关研究提供了新线索与新思路。此外，对于其他相关靶点和信号通路，未来还需进一步深入研究及实验验证。