左归降糖清肝方对糖尿病性脂肪肝小鼠PGC-1α 和DNMT3A 表达的影响

彭 泉，钟雁城，杨霄旭，成细华*

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 4102081；2.长春中医药大学针灸推拿学院，吉林 长春 130500

近年来2 型糖尿病（type 2 diabetes, T2DM）发病率呈递增趋势，2019 年全球有4.63 亿糖尿病患者，中国达1.3 亿人[1]。 有75%的T2DM 患者并发非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver, NAFLD），其进一步可向肝炎、肝纤维化及肝癌等肝病发展[1]。

过氧化物酶体增殖物激活受体-γ 共激活因子（peroxisomeproliferative activated receptor-γ activation of auxiliary factor1Alpha, PGC-1α)信号通路失调是2 型糖尿病性脂肪肝发生发展的关键机制[2]，而PGC-1α 信号失常与其DNA 甲基化异常密切相关，DNA 甲基转移酶抑制剂能恢复PGC-1α 信号[3]。 因此，抑制DNA 甲基转移酶（methyltransferase, DNMT）表达，能进一步影响PGC-1α 及其信号通路，改善糖尿病性脂肪肝。

糖尿病性脂肪肝具有本虚（脾肝肾亏虚、气阴两虚）标实（毒、瘀蕴积）的病机特点，据滋阴益气、清热利湿、化痰消瘀组方的左归降糖清肝方，能改善糖尿病性脂肪肝高糖脂及肝损伤[4-5]，然而其机制需深入研究。 本研究选用具有遗传变异的转基因2 型糖尿病MKR 鼠，加上高脂饲料喂养，模拟临床人类糖尿病性脂肪肝发生，建立糖尿病性脂肪肝动物模型[6]，经左归降糖清肝方干预治疗后，检测肝脏PGC-1α、TFAM、NRF1 和DNMT3A 表达，从分子水平探讨该复方是否调节PGC-1α 及其信号通路相关基因表达，缓解糖尿病性脂肪肝发生发展。

1 材料与方法

1.1 动物

24 只MKR 鼠（采用组织特异过度表达转基因技术产生），由美国国立卫生研究院提供纯合子MKR鼠[6]，经自然交配后繁殖的后代用于实验研究。小鼠在湖南中医药大学SPF 级实验动物中心饲养。伦理审核编号：XMBH-202203030004。饲养笼具、垫料、饮水的制备与消毒均符合SPF 级实验动物饲养要求。

1.2 药物和试剂

左归降糖清肝方由黄芪18 g、山药12 g、熟地黄12 g、黄连6 g、丹参9 g、茵陈15 g、虎杖12 g、郁金9 g、陈皮9 g 组成，均购自湖南中医药大学杏林药号。 制剂方法如下：加水先浸泡30 min，再按照W/V=1/8 量加水，将药材及水加入煎药机中煎煮至沸腾，15 min 后取滤液，两次煎药所得滤液混合，过滤浓缩至生药2.4 g·mL-1，4 ℃冰箱贮存备用。

甘油三酯（triglyceride, TG）、游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A110-1-1、A042-1-1）；动物组织总RNA提取试剂盒（批号：B511311-0025）、逆转录试剂盒（批号：B600020-0200）、Taq PCR 预混液（批号：B110006）、PCR 引物均购自生工物工程（上海）股份有限公司；多克隆一抗：β-肌动蛋白（β-actin）（京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-8770R）；PGC-1α、DNMT3A、超敏二步法免疫组织化学检测试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-7535R，bs-23029R、PV-0023）。

1.3 主要仪器

怡成超越JPS 型血糖测试仪；日本日立7150 全自动生化分析仪；BeckmanAllerga 25R 高速冷冻离心机；德国艾本德公司Realplex2 型荧光定量PCR仪；日本尼康公司DS-U3 型成像系统。

1.4 实验分组

24 只MKR 鼠，8 周时根据性别、体质量，随机分为对照组、高脂模型组和左归降糖清肝方（中药方）组，每组8 只。 高脂模型组和中药方组小鼠均以高脂饲料（高脂饲料为动物基础饲料加15%猪油、1%胆固醇）喂养8 周，无小鼠死亡，形成糖尿病性脂肪肝；造模成功的标准：空腹血糖≥11.1 mmol/L，小鼠肝细胞以弥漫性小泡性脂变为主，脂肪性变肝细胞达到70%以上，符合T2DM 合并NAFLD 的病变特点[4]。对照组以基础饲料喂养。 试验中无小鼠死亡。 高脂饲料喂养4 周后，中药方组以左归降糖清肝方生药29.64 g·kg-1灌胃[4-5]（中药药物剂量依据临床用药剂量，按人与动物体表面积计算法换算），对照组和高脂模型组以等体积蒸馏水灌胃，0.5 mL/20 g，每天1次，连续给药4 周。隔夜禁食不禁水12 h，小鼠称重后，取小鼠肝脏，称取肝脏湿重，计算肝指数（肝指数=肝质量/体质量×100%）。

1.5 肝组织形态学观察

取小鼠肝脏最大叶距边缘5 mm 处肝组织，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，病理切片，HE 染色后光镜观察，拍照。

1.6 肝脏TG 和FFA 的测定

取新鲜肝脏组织，用9 g/L 的生理盐水4 ℃制备10%的肝匀浆，3 000 r/min 离心15 min，取上清。 严格按照试剂盒要求测定TG 和FFA 含量；TG用单试剂GPO-PAP 法，酶标仪检测；FFA 用比色法检测（FFA 与铜离子结合形成脂肪酸的铜盐而溶于氯仿中，其含量与游离脂肪酸含量成正比）。

1.7 qRT-PCR 检测小鼠肝组织PGC-1α、TFAM、NRF1 和DNMT3A 的mRNA 表达

取各组小鼠新鲜肝脏组织，用动物组织总RNA提取试剂盒抽提取总RNA，采用紫外分光光度计测定其浓度。取1 μg 总RNA，随后用逆转录试剂盒，以Oligo(dT)为引物进行逆转录反应。 PCR 引物见表1。取cDNA，用Bio-Rad CFX Maestrol 1.0 Real-Time系统对目的基因进行荧光定量检测。 PCR 反应条件：预变性95 ℃，30 s，1 个循环。 PCR 反应95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；72 ℃，30 s；40 个循环。以β-actin作为内参，2-ΔΔCT法计算mRNA 的相对表达量[7]。

表1 目的基因和内参基因引物

1.8 Western blot 检测PGC-1α 和DNMT3A 的蛋白表达

将肝组织中加入RIPA（细胞裂解液）和PMSF（蛋白酶抑制剂），冰上裂解细胞30 min 后，4 ℃、12 000 r/min 离心5 min，收集上清，BCA 法测定蛋白浓度。 用10%～12%SDS 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，蛋白分离后在冷却的含20%甲醇的转移缓冲液中电泳转移至PVDF 膜。 转移后迅速置于TBS 液中，随后在室温下含5%脱脂奶粉的TBST 中封闭1 h，洗涤后用相应的一抗按1∶1 000 的比例稀释后4 ℃孵育过夜，脱色摇床洗膜3 次（15 min/次），用HRP耦联的山羊抗鼠，兔IgG 室温孵育2 h，洗涤后用ECL 化学发光试剂盒在凝胶成像分析系统（Bio-Rad公司）显影，使用软件分析条带灰度值分析[7]。

1.9 免疫组织化学检测PGC-1α 的蛋白表达

免疫组织化学严格按照试剂盒说明书进行操作。 不着色为阴性。PBS 取代一抗作阴性对照，已知阳性组织作阳性对照。 以细胞内有明显的棕黄色信号颗粒或信号斑为阳性[6]。

1.10 统计学分析

所有实验数据用SPSS 26.0 统计软件进行统计分析，结果用“±s”表示，多组间比较服从正态分布，采用单因素方差分析，组间方差齐时采用LSD 检验，方差不齐，采用GamesHowell(A)检验；不服从正态分布资料，采用秩和检验。P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 左归降糖清肝方对高脂饮食MKR 鼠肝脏病理形态的影响

光镜下可见，对照组MKR 鼠肝组织肝小叶结构正常，肝细胞规则排列，肝细胞大小正常，胞核位于细胞中央；高脂模型组MKR 鼠肝细胞则以弥漫性小泡性脂变为主；中药方组MKR 鼠肝组织脂肪性变程度明显改善。 详见图1。

图1 肝组织病理形态学变化（HE，×400）

2.2 左归降糖清肝方对小鼠血糖及肝指数的影响

与对照组比较，高脂模型组血糖、体质量、肝质量和肝指数差异均有统计学意义（P<0.01）。 与高脂模型组比较，中药方组小鼠除体质量外，血糖、肝质量和肝指数均有改善，差异均有统计学意义（P<0.01）。详见表2。

表2 左归降糖清肝方对小鼠血糖及肝指数的影响（±s，n=8）

表2 左归降糖清肝方对小鼠血糖及肝指数的影响（±s，n=8）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与高脂模型组比较，△△P＜0.01。

组别对照组高脂模型组中药方组血糖8.32±0.53 12.21±0.46**8.78±0.49△△体质量/g 21.350±2.14 25.21±3.38**24.14±1.82肝质量/g 1.098±0.104 2.231±0.143**1.564±0.073△△肝指数/（×10-2）5.143±0.034 8.849±0.101**6.488±0.058△△

2.3 左归降糖清肝方对小鼠肝脏TG 和FAA 的影响

与对照组比较，高脂模型组和中药方组肝脏TG和FAA 含量差异均有统计学意义（P<0.01）。与高脂模型组比较，中药方组TG 和FAA 含量均有下降，差异均有统计学意义（P<0.01）。 详见表3。

表3 左归降糖清肝方对小鼠肝脏TG 和FAA 含量的影响（±s，n=8，μmol/g）

表3 左归降糖清肝方对小鼠肝脏TG 和FAA 含量的影响（±s，n=8，μmol/g）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与高脂模型组比较，△△P＜0.01。

组别对照组高脂模型组中药方组TG 25.69±2.38 51.12±5.48**35.54±3.21△△FAA 31.64±2.41 96.46±7.87**56.89±5.21△△

2.4 左归降糖清肝方对高脂饮食MKR 鼠肝细胞PGC-1α、TFAM、NRF1 和DNMT3A mRNA 表达的影响

与对照组比较，高脂模型组PGC-1α、NRF1 和TFAM mRNA 表达下调，而DNMT3A mRNA 表达上调，差异均有统计学意义（P<0.01）。 与高脂模型组比较，中药方组能上调PGC-1α、NRF1 和TFAM mRNA表达，下调DNMT3A mRNA 表达，差异均有统计学意义（P<0.01）。 详见表4。

表4 各组小鼠PGC-1α、NRF1、TFAM 和DNMT3A mRNA表达比较（±s，n=6）

表4 各组小鼠PGC-1α、NRF1、TFAM 和DNMT3A mRNA表达比较（±s，n=6）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与高脂模型组比较，△△P＜0.01。

组别对照组高脂模型组中药方组PGC-1α 0.812±0.042 0.498±0.032**0.687±0.041△△NRF1 1.232±0.093 0.627±0.053**0.844±0.035△△TFAM 0.985±0.084 0.513±0.034**0.796±0.053△△DNMT3A 0.385±0.023 0.744±0.045**0.582±0.028△△

2.5 Western blot 检测左归降糖清肝方对高脂饮食MKR 鼠肝细胞PGC-1α 和DNMT3A 蛋白表达的影响

与对照组比较，高脂模型组和中药方组PGC-1α蛋白表达下调，而DNMT3A 蛋白表达上调，差异均有统计学意义（P<0.01）；与高脂模型组比较，中药方组能上调高脂饮食MKR 鼠PGC-1α 蛋白表达，下调DNMT3A 表达，差异均有统计学意义（P<0.01）。详见图2。

图2 左归降糖清肝方对高脂饮食MKR 鼠肝细胞PGC-1α 和DNMT3A 蛋白表达的影响（n=3）

2.6 免疫组织化学检测左归降糖清肝方对高脂饮食MKR 鼠肝细胞PGC-1α 蛋白表达的影响

免疫组织化学显示，PGC-1α 蛋白分布在胞浆，染色后成棕褐色，在MKR 鼠肝细胞中PGC-1α 含量高，高脂饮食MKR 鼠肝细胞中明显减少，左归降糖清肝方能增加PGC-1α 蛋白表达。 详见图3。

图3 左归降糖清肝方对高脂饮食MKR 鼠肝细胞PGC-1α 蛋白表达的影响（免疫组织化学，×400）

3 讨论

TM2D 中NAFLD 的发生率持续增加，正成为主要的健康负担，但目前缺乏标准的治疗方案[8-9]。 中医药在防治糖尿病性脂肪肝中凸显优势[4-5,10-11]。糖尿病性脂肪肝，据其临床特点，中医学将其归属于“消渴”“胁痛”“积聚”等范畴，其主要病因为饮食不节、起居无常、不知持满、不时御神、情志失调、久病体虚。 据滋阴益气、清热利湿、化痰消瘀组方的左归降糖清肝方，能减轻高脂饮食加剧的MKR 鼠的胰岛抵抗，降低血糖、ALT、AST 和血脂水平[4-5,11]。

在骨骼肌、肝脏、褐色脂肪组织和心脏的脂质代谢中，PGC-1α 促进NRF1 表达，NRF1 随后上调TFAM，进而刺激线粒体DNA(mtDNA)转录和复制，促进线粒体生物合成，从而调控氧化磷酸化相关酶的表达来调节脂质代谢[12-13]。 此外PGC-1α 具有直接调节脂质代谢转录因子[如过氧化物酶体增殖剂激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptor α, PPARα）、固醇调节元件结合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c, SREBP-1c）等的效应，促进了线粒体脂肪酸β 氧化，抑制脂肪酸合成，参与脂质代谢[14-15]。 肝脏、骨骼肌等器官PGC-1α 表达异常，线粒体功能紊乱和脂肪酸β 氧化不完全是2 型糖尿病性脂肪肝发生的主要机制[3]。 本实验中，高脂饮食MKR 鼠肝脏PGC-1α、NRF1 和TFAM的mRNA 表达显著下降（P<0.01），PGC-1α蛋白表达也显著下降（P<0.01），与本研究团队前期研究高脂饮食MKR 鼠PGC-1α 调控的SREBP-1c 表达水平显著增加的结果是一致的[16]，表明高脂饮食MKR 鼠肝脏中PGC-1α 下调，出现线粒体功能低下，脂肪酸β-氧化下降，脂肪酸合成增加，脂质在肝脏内不断积累成脂肪肝；左归降糖清肝方能上调糖尿病性脂肪肝小鼠PGC-1α 表达，进一步调节PGC-1α 信号通路，降低肝脏脂质堆积。

DNA 甲基化与糖尿病及其并发症的发生密切相关[3,17-18]，缺乏胆碱和叶酸饮食的A/J 和WSB/EiJ小鼠，肝脏DNMT1 和DNMT3A 上调，高甲基化改变与肝脂质堆积及损伤显著相关[19]；在神经细胞中发现，FFAs 诱导了PGC-1α 启动子高甲基化，导致PGC-1α 表达减少[20]。 本实验中，高脂饮食MKR 鼠肝脏DNMT3A 表达显著增加，与PGC-1α 表达呈负相关。本研究团队推测，可能PGC-1α 存在DNA 甲基化异常，抑制了PGC-1α 表达。左归降糖清肝方干预治疗后，高脂饮食MKR 鼠肝脏DNMT3A mRNA 和蛋白表达均显著降低，PGC-1α 则显著上升，说明该复方可能通过下调DNMT3A 表达，减少PGC-1α 甲基化，促进PGC-1α 表达，减少肝脏脂质堆积。

本实验结果初步证明，左归降糖清肝方可调节PGC-1α 及其信号通路基因表达来减缓脂肪肝的发生，从分子水平证实了该复方能缓解糖尿病性脂肪肝的发展，对肝脏具有保护作用。 同时发现，该复方可以抑制高脂饮食MKR 鼠肝脏DNMT3A 基因表达，推测该复方通过下调DNMT3A 表达，减少PGC-1α DNA 甲基化，从而促进PGC-1α 表达，进一步调节肝脏脂肪代谢相关基因表达，减少肝脏脂质堆积。本研究团队后期将进一步通过体外实验，设计甲基化酶激活剂组和抑制剂组等，检测PGC-1α 启动子甲基化水平及PGC-1α 下游通路，深入研究左归降糖清肝方基于DNA 甲基化修饰调控PGC-1α 通路防治糖尿病性脂肪肝的作用机制。