基于氧化应激基因构建肝细胞癌预后模型及潜在中药预测分析

徐子悟，朱政清，梁文萱，李 霞，李云耀，周颖倩，刘碧源，孟 蕾*

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南大学，湖南 长沙 410012；3.湖南省人民医院，湖南 长沙 410005；4.湖南交通工程学院，湖南 衡阳 421001

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是最常见的肝癌， 约占所有原发性肝脏恶性肿瘤的80%，其发病率和死亡率在全球范围内均在增加[1]。 尽管目前在HCC 筛查和治疗方面取得新进展，但大多数HCC 患者在诊断时仍处于晚期[2]。 因此，寻找一种新的灵敏且可靠的预后模型，准确预测患者生存率并合理指导治疗方案至关重要。

氧化应激是HCC 发生和发展的关键因素，参与HCC 的迁移、侵袭和转移[3]。 目前，已有试验将氧化应激生物标志物用于临床治疗HCC 和预测术后HCC 复发[4]。 研究表明，许多传统中药都含有抗氧化活性的成分，参与调节氧化应激[5]。 在现代临床治疗中，传统中药因其低毒性和良好的临床疗效，已被纳入许多疾病的治疗方案[6]。

本文拟构建可以精确预测HCC 患者的氧化应激相关基因预后模型，并预测作用模型中枢基因的中药单体成分，以期为治疗HCC的靶向中药研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 数据收集和预处理

从TCGA 数据库（https://portal.gdc.cancer.gov）下载LIHC 队列的转录组测序数据、体细胞突变数据和临床数据。此外，在GEO 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）补充以GSE14520、GSE62232、GSE74656 HCC 患者转录组测序数据集。 氧化应激相关基因通过Genecards 数据库检索“氧化应激”，以相关评分≥7 分作为筛选条件获得。

1.2 转录组差异分析

利用R 语言“DESeq2”包对TCGA-LIHC 原始Counts 数据进行差异分析。GEO 数据库的GSE14520、GSE62232、GSE74656 使用“limma”包分析差异表达基因。

1.3 氧化应激相关基因预后模型构建

TCGA-LIHC 与GSE62165、GSE62452、GSE28735的共同差异基因（differential genes, DEGs）与获得的1 399 个氧化应激相关基因取交集，获得差异表达的氧化应激相关基因。 通过单/多变量Cox 回归、Lasso 回归分析预后特征基因。 通过生存分析和ROC 分析，以验证模型可靠性。

1.4 免疫组织化学图像分析

从人类蛋白质图谱（https://www.proteinatlas.org/）获得人类健康组织和HCC 患者组织的免疫组织化学图像，用于在蛋白质水平上验证。

1.5 功能相关中药预测

通过Coremine Medical 数据库（https://coremine.com/medical/），以P<0.05 作为筛选标准，预测对模型关键基因有潜在调控作用的中药。药物的性味、归经通过2020 版《中华人民共和国药典》进行搜集。 使用TCMSP、HERB、ETCM、TCMID 数据库检索中药成分，使用SwissADME（www.swissadme.ch）以MW<500、Hdon<5、Hacc<10、LogP<5 为筛选条件筛选中药成分。 最终基于Autodock vina[7]软件对筛选后的中药成分进行分子对接。

1.6 中药水提物制备

中药材于80 ℃水中熬煮6 h，水提3 次。 提取液过滤，去除残渣后，将提取液放入旋转蒸发仪浓缩成浸膏，喷雾干燥获得药物干粉，用于后续实验。

1.7 细胞培养及处理

用含10%胎牛血清的DMEM 培养基在37 ℃、5% CO2条件下常规培养Hep3B 细胞，培养基每2～3 d 更换1 次。 当细胞汇合度约为90%时，用0.25%胰蛋白酶溶液进行传代培养。

1.8 细胞活力评估

Hep3B 细胞以5×103个/孔接种于96 孔板，分别使用不同浓度马钱子水提物和龙葵水提物（0、0.390 625、0.781 25、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg·mL-1）干预HepG2 细胞48 h 和72 h 后，每孔加入100 μL 10% MTT 溶液，4 h 后用酶标仪测定490 nm 处吸光度（A），计算细胞存活率。 细胞存活率=（A 加药－A 空白）/A 空白×100%。

1.9 Westorn blot 检测

使用IP 裂解缓冲液制备来自Hep3B 细胞系的全蛋白裂解物，然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹。 所用抗体及其稀释浓度如下：SLC7A11（1∶2 000）、β-Actin（1∶2 500）（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为AA128、AF7992）。

2 结果

2.1 HCC 患者基本信息

本研究数据转录组来源TCGA 数据库，TCGA临床数据见表1。

表1 TCGA 列队基线资料表

2.2 筛选差异氧化应激相关基因

对TCGA 数据库和GSE14520、GSE62232、GSE-74656 数据集进行差异分析，分别有4 531、1 222、1 442 和972 个基因被鉴定为DEGs（图1A—D）。4 个数据集共有356 个交集DEGs（图1E），其中47 个基因被识别为氧化应激相关DEGs（图1F）。

图1 HCC 氧化应激相关基因鉴定

2.3 预测模型的构建与评价

单变量Cox 回归鉴定31 个预后相关基因（图2A），Lasso 回归筛选进一步筛选出7 个基因（图2B—C）。 多变量Cox 回归以SLC7A11（P=0.047）和EZH2（P=0.016）构建预后相关基因模型（图2D）。 ROC 曲线显示模型可以灵敏地预测患者的生存状况 （图2E）。 高风险组相较低风险组平均生存年数更低（图2F），生存率显著低于低风险组（P<0.001）（图2G）。

图2 HCC 氧化应激相关关键基因患者预后模型及其预后效能

2.4 关键基因的生存分析与表达验证

TCGA 和GEO 数据库配对样本数据集表明，EZH2 和SLC7A11 的表达在HCC 患者中均有显著增加（P<0.001）（图3A—B），并且与与预后相关（P<0.001）（图3C—D）。为了进一步验证，本研究团队使用从Human Protein Atlas 公共数据库获得到肝癌患者组织和健康肝组织中IHC 图像，可见肝癌组织中的EZH2 主要定位于细胞核内，且蛋白表达增加（图3E）。

图3 关键HCC 氧化应激相关基因表达水平

2.5 相关中药网络和分子对接

通过Coremine Medical 医学数据检索到作用模型基因EZH2 中药24 味，SLC7A11 潜在中药9 味（表2）。 灰色底色为Affinity>-7.0，蓝色底色为Affinity<-7.0，深蓝色底色为中药成分，红色底色为关键基因的蛋白靶点（图4A）。 对中药进行性味、归经分析，大部分中药具有性寒、味苦特点，肝经为主要富集的经络（图4B—D）。在对中药成分与相应模型蛋白的对接结果中，丹参、白芷、马钱子等中药成分与模型蛋白有较好亲和力（图4E）。其中，龙葵的5'-甲氧基松脂素和马钱子的马钱子N-氧化物（brucine Noxide, BNO）Affinity<-10.0，分别作用SLC7A11 的247号丙氨酸和198 号赖氨酸（图4F）。

图4 HCC 氧化应激相关中药成分网络以及对接结果

表2 关键基因的中药预测

2.6 关键药物抑制Hep3B 细胞的增殖和SLC7A11蛋白表达

以梯度浓度龙葵和马钱子水提液分别干预Hep3B 细胞，结果显示药物对Hep3B 细胞的抑制能力呈时间和剂量依赖性（图5A）。以48 h 条件下药物的1/2×IC50药物浓度干预细胞后检测SLC7A11 靶点表达情况显示，龙葵和马钱子水提液能够抑制SLC7A11 蛋白的表达（图5B）。

图5 龙葵（LK）和马钱子（MZQ）水提液对Hep3B 细胞增殖和SLC7A11 蛋白表达的影响

3 讨论

HCC 是全球第三大致死癌症类型，需要有效的治疗和诊断策略来预防其发生发展和转移氧化应激显著影响各种功能和过程，如细胞增殖、分化、血管生成和代谢，并与各种疾病的病理生理学有关[4]。肝脏是ROS 攻击的主要器官，伴随着过量的ROS，氧化应激和细胞代谢受损参与肝损伤的发生和发展[8]。 有研究证明，氧化应激会促进非酒精脂肪肝发生各类病理性变化，并将进一步促进肝癌发生[9]。

本文基于氧化应激相关基因成功地筛选出EZH2、SLC7A11，并以此构建了HCC 中的氧化应激相关基因的预后模型，其有效性在Kaplan-Meier 曲线和时间依赖ROC 曲线得以证明，尤其是在第5 年时AUC 为0.650，说明该模型具有良好的预测能力。通过分析模型基因的表达情况，发现高表达EZH2或SLC7A11 的HCC 患者，其预后情况较差，这与目前研究一致[10]。中药已经发展了数千年，虽然中药配方中的化学成分复杂，但中药的这一特点与肿瘤的全系统、多靶点治疗相适应[11]。本研究预测了预后模型中关键基因的潜在治疗中药。 BNO 是马钱子在炮制过程中由毒性成分马钱子碱转化而来的一种特殊生物碱[12]，具有引发线粒体凋亡途径诱导HCC 凋亡的功能[13]。而目前在癌症治疗方面尚无有关5'-甲氧基松脂素的研究。 本文研究中预测到马钱子中的BNO 与SLC7A11 的赖氨酸具有很强的亲和力。此外，作用模型关键基因的中药主要富集于肝经，性寒味苦也是归肝经中药的特点[14]，表明在HCC 中EZH2和SLC7A11 积极的治疗潜力。

研究进一步通过MTT 法检测马钱子以及龙葵水提物对Hep3B 肝癌细胞系增殖的影响，结果展示出细胞存活率随着药物浓度和处理时间的增加而下降，说明两味中药具有抑制Hep3B 细胞增殖的能力。此外，通过检测细胞中SLC7A11 蛋白表达，发现在马钱子以及龙葵水提物处理细胞后，Hep3B 细胞的SLC7A11 蛋白表达水平下降，说明两位中药能够下调SLC7A11 水平。

EZH2 是一种组蛋白甲基转移酶，能三甲基化组蛋白H3 的27 位赖氨酸（H3K27me3）。EZH2 的活化有助于表观遗传转录沉默，而非突变表观遗传重编程已经被认为是癌症新的重要特征之一[15]。 EZH2可通过T 细胞功能障碍和T 细胞排斥促进肿瘤免疫逃逸[16]。 SLC7A11 是溶质载体（Solute Carrier, SLC），属于胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白，主要负责质膜上氨基酸的转运[17]。 SLC7A11 在铁死亡中扮演着关键调控者的角色。 铁死亡作为一种非凋亡性细胞死亡过程，已成为肿瘤治疗的新靶向策略[18]。SLC7A11 还是作为控制Treg 细胞增殖潜能的关键决定因素[19]。

综上所述，本研究成功构建了一个基于氧化应激相关基因EZH2 和SLC7A11 的HCC 预后模型，该模型能够敏感地预测患者的生存状况。 此外，通过对模型相关基因的分析，本研究丰富了传统中药对于模型中关键基因治疗的理解。 同时，模型中的关键基因在肿瘤治疗方面也具有重要的研究价值，有望成为潜在的治疗靶点。