GC-MS、UPLC-Q-TOF-MS/MS 结合网络药理学探讨地锦草药效物质基础及其抗炎作用机制

陈迪路，姚思凡，孙伍慧，张 艺，赵碧清*，周小江，3

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.武汉市金银潭医院，湖北 武汉 430023；3.湖南省中药饮片标准化及功能工程技术研究中心，湖南 长沙 410208

炎症是机体对感染或组织损伤做出的天然防御机制，是一个复杂的病理过程[1]，疼痛、发红、发热、肿胀和浮肿是炎症的基本症状[2]。 机体免疫像一把“双刃剑”：一方面，可以防御机体免受感染等刺激带来的损伤，有助于疾病的痊愈；另一方面，控制不当则会对机体功能造成损伤[3]。 非甾体抗炎药常用于治疗炎症，但长期使用这些药物会导致胃肠道溃疡、肾功能不全和出血[4-5]。 现代研究表明，中药凭借其多成分、多靶点的特点，在抗炎方面发挥重要的作用[6-7]。因此，从中药中寻找疗效显著、不良反应小的炎症抑制剂具有重要意义。

地锦草现收载于《中华人民共和国药典》2020年版，为大戟科植物地锦Euphorbia humifusa Willd.或斑地锦Euphorbia maculate L.的干燥全草，具有清热解毒、凉血止血、利湿退黄的功效[8]，临床上用于治疗痢疾、泄泻、疮疖痈肿、湿热黄疸等，具有抗炎、抗菌、抗病毒等作用。 其化学成分主要为黄酮类、三萜类、鞣质及酚酸类化合物[9]。 其中，槲皮素、山柰酚等黄酮类和棕榈酸等酚酸类成分均具有抗炎活性[10-12]。 研究发现，地锦草总黄酮可保护脓毒症大鼠的肠道屏障功能，降低炎症反应及氧化应激反应的发生，控制炎症并发症的发生及发展[13-15]。 然而，关于地锦草化学成分种类，尤其是体内抗炎活性物质的研究较少，其药效物质基础尚不明确。

网络药理学以系统生物学的理论为基础，通过多成分、多靶点、多通路的角度阐述药物与疾病的关联性，对中药物质基础、作用机制研究的发展起到了重要作用[16-18]。 本研究采用GC-MS、UPLC-Q-TOFMS/MS 分析地锦草的化学成分，采用网络药理学探究其活性成分抗炎作用的靶点和通路，为地锦草这一药用资源的合理开发利用提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

Sciex ExionLC AD 液相色谱仪（美国SCIEX 公司）；SCIEX X500R QTOF（美国SCIEX 公司）；ISQTM 7000 气相色谱质谱联用仪（德国赛默飞世尔科技公司）；TRACE 1300 气相色谱仪（德国赛默飞世尔科技公司）；CP214 分析天平（美国奥豪斯公司）；SorvaLL ST8R 高速离心机（美国赛默飞世尔科技公司）。

1.2 试药

地锦草采于湖南中医药大学周边，经湖南中医药大学许光明教授鉴定为大戟科植物地锦Euphorbia humifusa Willd.的干燥全草。色谱甲醇购自德国默克公司（批号：I1099407026）；色谱甲酸购自德国CNW 公司（批号：71140180）；纯净水购自华润怡宝饮料有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 数据库与软件

中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP,https://tcmspw.com/index.php）；PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SwissTargetPrediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）；GeneCards数据库（http://www.genecards.org/）；DrugBank 数据库（http://go.drugbank.com）；DisGeNET 数据库（https://www.disgenet.org/home/）；STRING 11.5数据库（https://cn.string-db.org/）；DAVID 6.8 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape 3.9.0 软件。

2 方法

2.1 供试品溶液制备

取地锦草药材适量，加10 倍量70%乙醇，浸泡1 h 后回流提取1.5 h，冷却过滤后再加8 倍量70%乙醇，提取1 h，过滤，合并2 次滤液，浓缩至无醇味，备用。

2.1.1 GC-MS 溶液制备 将提取后的样品用石油醚萃取，充分摇匀静止后，取石油醚层，减压干燥得浸膏。 精密称取0.266 5 g 地锦草石油醚层浸膏，用石油醚溶解，定容至25 mL 容量瓶，在12 000 r/min、半径6 cm 条件下离心15 min，取上清液分析。

2.1.2 LC-MS 溶液制备 将提取后的样品用乙酸乙酯和正丁醇分别萃取，减压干燥得浸膏。 分别精密称取0.2 572 g、0.2 391 g，用色谱甲醇溶解，定容至25 mL 容量瓶，在12 000 r/min、半径6 cm 条件下离心15 min，取上清液分析。

2.2 GC-MS 条件

2.2.1 色谱条件 以Thermo scientific TG-5SILMS GC Column（30 m×0.25 mm×0.25 μm）型色谱柱为固定相，进样口温度280 ℃；载气为高纯氦气；流速1.0 mL/min；不分流进样；进样体积为1.0 μL；升温程序：起始温度40 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率升至280 ℃，保持4 min。

2.2.2 质谱条件 EI 源(70 eV)，质谱转换线温度280 ℃，离子源温度300 ℃，全程扫描，扫描间歇0.2 s，质量范围45～350 m/z。

2.3 LC-MS 条件

2.3.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm×1.7 μm）色谱柱，流动相为0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脱：0～25 min，10%～30% B；25～26 min，30%～50% B；26～35 min，50%～65% B；35～36 min，65%～85% B；36～50 min，85%～100% B；柱温35 ℃；进样体积10 μL；流速0.3 mL/min。

2.3.2 质谱条件 离子化模式为电喷雾正、 负离子模式，各化合物IDA 模式母离子多重离子扫描，一级锥孔电压分别为80 V、-80 V，碰撞电压分别为10 V、-10 V，一级质谱母离子扫描范围为100～1 000 m/z。

2.4 基于网络药理学预测地锦草抗炎作用机制

基于GC-MS、UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析得到地锦草化学成分信息，结合TCMSP 和地锦草相关文献，采用PubChem 数据库获取化合物的结构图，将所获取的化合物结构导入Swiss Target ADME 数据库筛选其活性成分。 筛选标准：肠胃吸收（gatrointesti nal absortion；GIabsortion）为“high”；Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 结果中有2 个及2 个以上为“yes”[19]。采用SwissTargetPrediction 数据库预测成分靶点，合并去重后获得地锦草成分靶点。 在GeneCards、DrugBank、DisGeNET 3 个数据库中搜索“anti-inflammatory”“inflammation”，获得与之相关的基因，合并数据库的查找结果并删除重复靶点，所得靶点即为相关靶点。将成分靶点和疾病靶点取交集，获得交集靶点。 将交集靶点导入STRING 数据库，获得靶点间相互作用关系并导入Cytoscape 3.9.0 软件，构建PPI 网络，对各靶点网络特征进行分析，以度值（Degree）、介数中心性（Betweenness）、接近中心性（Closeness）均大于其平均值进行筛选，获得核心靶点，采用DAVID 6.8数据库对靶点进行GO 生物过程富集分析和KEGG通路分析。 最终，构建地锦草抗炎作用的“活性成分-核心靶点-通路”关联网络。

3 结果

3.1 地锦草化学成分鉴定

3.1.1 GC-MS 分析结果 通过Thermo Chromeleon数据分析软件结合NIST14 标准质谱库和相对保留指数，对总离子流图中的各峰进行分析，以面积归一化法测得地锦草石油醚层中各组分相对质量分数，结果共鉴别出50 个化合物。 详见图1 与表1。

表1 地锦草GC-MS 化学成分分析鉴定

图1 地锦草石油醚层GC-MS 总离子流图

3.1.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析结果 采用UPLCQ-TOF-MS/MS 技术分别对地锦草中的乙酸乙酯和正丁醇部位的化学成分进行定性分析，正、负离子模式下的总离子流图见图2。通过一级和二级质谱信息分析并结合相关文献，从地锦草图谱中共鉴定出76个化学成分，主要为黄酮类、有机酸类成分。 详见表2。

表2 地锦草UPLC-Q-TOF-MS 化学成分分析鉴定

图2 地锦草UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析的总离子流图

3.2 基于网络药理学的地锦草抗炎作用机制预测结果

3.2.1 地锦草有效成分的获得 基于“2.4”项下的筛选原则，共筛选获得活性成分12 个。详见表3。进一步采用SwissTargetPrediction 数据库预测，获得成分靶点1 001 个，删除重复靶点后共得到成分靶点214 个。

表3 地锦草有效成分信息

3.2.2 疾病靶点的获得 在GeneCards、DrugBank、DisGeNET 3 个数据库中搜索“Anti-inflammatory”“Inflammation”，获得与之相关的靶点，合并数据库的查找结果，并删除重复项后得到10 688 靶点。 将成分靶点和疾病靶点取交集，获得交集靶点198 个，作为地锦草抗炎作用的潜在靶点。 详见图3。

图3 成分靶点与疾病靶点韦恩图

3.2.3 PPI 网络的构建及核心靶点筛选 将交集靶点导入STRING 11.5 数据库，获得靶点间相互作用关系，保存为TSV 文件。 进一步将数据导入Cytoscape3.9.0 软件，构建PPI 网络。 详见图4。 对各靶点网络特征进行分析，以度值（Degree）、介数中心性（Betweenness）、接近中心性（Closeness）均大于其平均值进行筛选，其中Degree>318.548 2，Betweenness>257.126 9，Closeness>0.002 2，筛选出37 个靶点。其中，排名靠前的蛋白激酶B 1（kinases-protein kinase B 1, Akt1）、表皮生长因子受体A（epidermal growth factor receptor A, EGFRA）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）、SRC、ESR1、酪氨酸激酶受体2（ERBB2）、环氧合酶2（cyclooxygenase-2,PTGS2）、过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARG)可能为地锦草抗炎作用的关键靶点。

图4 交集靶点的PPI 网络

3.2.4 富集分析及成分靶标通路功能网络的构建 采用DAVID 6.8 数据库对地锦草抗炎的37 个核心靶点进行功能注释分析（GO 分析），包含生物学过程（bioprogress, BP），细胞组分（cell components, CC）和分子功能（molicular function, MF）3 个方面，选取其P 值最小的前10 个数据进行可视化处理，见图5A。DAVID 网站分析共得到66 条KEGG 通路，选取P值最小的且与炎症密切相关的前10 个通路进行可视化处理，见图5B。结果表明，与地锦草抗炎作用密切相关的信号通路主要包括磷脂酰肌-3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B, PI3K/PKB）信号通路、Ras 信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）信号通路、钙信号通路、Ras 相关蛋白1（Rasrelated protein 1, Rap1）信号通路等。将KEGG 通路图进行深度分析和整合，构建抗炎调控机制图，详见图6。

图5 GO(A)和KEGG(B)富集分析结果

图6 地锦草抗炎调控机制图

4 讨论

GC-MS 联用仪具有灵敏度好、分辨率较好、有标准质谱库等优点，适合中药样品中复杂的挥发性成分分析，鉴定化合物快捷且简便[20-21]。 结果显示，地锦草石油醚层共鉴定出50 个化学成分，挥发性主要成分为酸类、酯类、酮类等物质，主要挥发性成分为棕榈酸等[22]。 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术共从地锦草乙酸乙酯和正丁醇提取物中鉴定出76 个化学成分，主要为黄酮类、有机酸类成分[23-24]。

近年来，网络药理学在中药及复方有效成分筛选、靶点及通路的预测方面得到了广泛应用[25-26]。 通过网络药理学预测中药活性成分、作用靶点及作用通路，能够节约药物开发成本，同时也为中药的机制研究提供新思路[27-28]。 本研究通过地锦草“活性成分-靶点-通路”网络，挖掘地锦草抗炎作用的关键作用靶点，探索潜在的抗炎机制。 黄酮类和酚酸类化合物是地锦草中主要化学成分，大量研究表明，此类化合物具有抗炎作用。 本研究筛选出的12 个活性成分，也主要为黄酮类成分，具体包括鞣花酸、山柰酚、芹菜素、槲皮素、柚皮素、木犀草素等。 网络药理学筛选得出的部分化合物未能采用质谱从植物中鉴定，可能与化合物在地锦草中含量较低，以及提取时的溶剂极性、温度等不符有关，但其类药性和口服生物利用度均高于其他被鉴定出来的提取物。且由于这些高活性化合物在低浓度下也有显著的药理活性，故结合TCMSP 数据库，将这些成药性较高，但含量较低的化合物纳入了网络药理学研究。

地锦草抗炎作用的核心靶点包括KT1、EGFR、VEGFA、SRC、ESR1、ERBB2、PTGS2、PPARG 等。 据文献报道，槲皮素可以负调节巨噬细胞介导的体外炎症反应和脂多糖诱导的腹膜炎，对炎症介质的释放以及SRC 的酶活性具有抑制作用[29]。 芹菜素可提升肺炎链球菌脑膜炎大鼠神经系统评分，减轻炎症反应，抑制大鼠脑组织细胞凋亡，对肺炎链球菌脑膜炎大鼠脑损伤起保护作用[30]。 鞣花酸可以明显改善脑缺血再灌注大鼠的血脑屏障、脑组织损伤、运动和探索行为，有效抑制炎症反应[31]。 此外，鞣花酸还能够修复肠黏膜屏障，抑制NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3 炎症小体活化，下调胱天蛋白酶-1表达水平，显著改善脂多糖诱导的小鼠急性肠道炎症[32]。结合文献及网络药理学结果表明，地锦草中的黄酮类成分芹菜素、槲皮素、木犀草素等，以及鞣花酸等多酚类化合物可能为抗炎的关键成分，VEGFA、SRC、ESR1 等可能为抗炎的关键靶点。

根据KEGG 分析，地锦草抗炎作用与PI3K/Akt、ErbB、VEGF、甲状腺激素、雌激素等信号通路有关。PI3K/Akt 信号转导通路是经典的调控细胞分化、促细胞存活、抗细胞凋亡的通路，Akt 是PI3K/Akt 信号通路的关键环节，PI3K/Akt 信号通路对多种生命活动的调控均有赖于Akt 的磷酸化[33]。PI3K/Akt 信号通路参与NDMA 诱导的肺纤维化的病因，通过PTEN介导抑制PI3K/Akt、NF-κB 和MDM2-p53 信号通路，发挥抗氧化、抗炎和抗凋亡作用[34]。研究发现，木犀草素以剂量依赖方式抑制Akt 的磷酸化，减轻脂多糖诱导的炎症反应， 通过NF-κB/AP-1/PI3K/Akt信号通路显著抑制NO 和PGE-2 的产生[35]。VEGFA能够介导炎性细胞的募集，并增强募集和驻留的单核细胞上共刺激分子的表达[36]。研究表明，槲皮素可以减轻胶原诱导性关节炎大鼠关节炎症，提高对关节软骨和骨的保护作用，通过抑制胶原诱导性关节炎大鼠关节滑膜VEGFA 的表达，发挥抗血管新生作用[37]。本研究结果提示，地锦草可能通过作用于关键靶点，调控以上信号通路发挥抗炎作用。

地锦草通过多成分、多靶点、多通路的协同作用发挥抗炎作用，为后续地锦草抗炎作用的靶点和通路研究奠定基础，为其深入研究与应用提供了科学依据和数据支撑，对深入阐述中药的活性成分、药效学作用及相关机制具有重要作用。 今后可以加强药理学实验，验证地锦草对关键靶点的调节作用以及药物对机体的免疫调节作用。