推拿法介导机械敏感性离子通道Piezo1 对骨骼肌损伤模型大鼠细胞凋亡的影响

黄 博，阮 磊，王兰兰，薛惠天，孙梦龙，段苗苗，彭 亮*

1.湖南中医药大学针灸推拿与康复学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007

骨骼肌损伤是骨骼肌纤维受到外力击打或长期耐力牵拉引起损伤的一类创伤性疾病， 是人们日常锻炼或运动员专业训练中常见的损伤。 在运动所受的损伤类型中，最主要的是骨骼肌损伤，占所有损伤的40.9%[1]。机械门控离子通道Piezo1 可将细胞膜接收到的机械力学信号转换为电信号或化学信号，传递至胞内引起一系列生化反应。 国外研究报道，肌肉损伤可由细胞凋亡诱导[2]。而Piezo1 可能参与骨骼肌损伤时细胞凋亡的过程，在损伤后，Piezo1表达下降会导致更多的骨骼肌细胞凋亡[3]。 由于Piezo1 可直接感受到膜张力的变化而进行门控，因此，任何改变膜张力的生理作用力理论上都可激活Piezo1 通道[4]。

推拿是中医传统治疗手法，有其独特的生物力学特征[5]，同样属于细胞外力学机械刺激，在骨骼肌肉疾病中进行推拿治疗可以缓解疼痛并改善功能[6]，其中，法是临床上治疗骨骼肌损伤的常用手法。本课题组前期研究表明，推拿法可促进骨骼肌损伤后的修复进程，减少炎症反应，抑制组织纤维化，加快功能恢复[7-8]。 本实验在前期研究基础上，复制虎蛇毒素（notexin, NTX）诱导的大鼠骨骼肌损伤模型，观察作为细胞外力学机械刺激的推拿手法——法对大鼠骨骼肌损伤后运动功能、组织形态学、Piezo1、B 淋巴细胞瘤-2 （B-lymphoma-2, Bcl-2）、B淋巴细胞瘤2 相关X 蛋白质（B-lymphoma-2 related X protein, Bax）、胱天蛋白酶-3（cysteine aspartic acid specific protease-3, Caspase-3）的影响，探讨推拿法治疗骨骼肌损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物

健康SPF 级雄性SD 大鼠32 只，体质量220～250 g，由湖南中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK（湘）2019-0004。 每笼4 只，饲养于温度20～25 ℃，湿度50%～70%的环境中，所有大鼠均按标准饮食喂养，并保持12 h 光照/12 h 黑暗周期。 本研究已通过湖南中医药大学实验动物伦理委员会审查和批准（审批号：LLBH-202106070002)。

1.2 主要试剂与仪器

NTX（法国Latoxan 公司，批号：L8104-100UG）；戊巴比妥钠（德国Merck KGaA 公司，批号：P3761）；4%多聚甲醛（安徽白鲨生物有限公司，批号：BL539A）；苏木素染液套装（武汉谷歌生物科技有限公司，批号：G1005）；TUNEL 试剂盒（瑞士Roche 公司，批号：11684817910）；DAPI 染液（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C1002）；Bax 抗体（美国AAB 公司，批号：A23917）；Caspase-3 抗体（批号：AD6311）、Bcl-2 抗体（批号：DF14173）、Piezo1 抗体（批号：DF12083）均购自美国Affinity 公司；β-actin 抗体（批号：MD6553）、HRP 山羊抗兔二抗（批号：MD912565）、HRP 山羊抗小鼠二抗（批号：MD912566）均购自英国MDL 公司；PVDF 膜（美国Millipore 公司，批号：ISEQ00010）。

1.3 分组及造模

32 只SD 大鼠适应性饲养1 周后，按照随机数字表法分成正常组、模型组、法组、法+抑制剂组，每组8 只。 除正常组外，其余各组建立SD 大鼠腓肠肌损伤模型[9]。 具体操作如下：在大鼠的右侧下肢腓肠肌部位进行剃毛处理，用马克笔画圈标记。 以1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，保证每只大鼠注射部位一致。 在大鼠的右侧下肢腓肠肌以10 μg/mL 肌内注射200 μL NTX，造成肌内损伤，肌内注射NTX 时缓慢推进液体，并在注射完毕后停留3 s 再拔出针头，以保证每只大鼠腓肠肌充分吸收药物。 肌内注射24 h 后观察平衡木测试结果，大鼠行走时间延长、滑爪次数增加，表明造模成功[10-11]。正常组大鼠在同样位置注射200 μL 生理盐水。

1.4 干预方法

1.5 观察指标及方法

最后一次干预结束后，禁食不禁水24 h，采用平衡木测试进行行为学评估以观察大鼠运动功能。行为学测试结束后，腹腔注射过量戊巴比妥钠麻醉处死各组大鼠，立即手术切取腓肠肌标记部位组织，平均分成两份：一份浸润于4%多聚甲醛中用于HE染色和TUNEL 染色；另一份组织放入-80 ℃冰箱冻存，待测相关蛋白表达水平。

1.5.1 行为学测试 干预前以及最后一次干预结束后，对4 组大鼠进行平衡木测试[11]。平衡木测试主要评估大鼠骨骼肌损伤后的运动协调性。 将木梁（2 cm×120 cm）提升到离地面120 cm 的高度，记录大鼠穿过木梁后到达暗箱所需的时间以及爪子滑动的次数。在测试前1 天进行3 次适应性试验，目的是让大鼠熟悉木梁和暗箱。每次试验后用75%乙醇清洗木梁和暗箱。

1.5.2 组织学观察 将浸润于4%多聚甲醛中的腓肠肌组织块进行石蜡包埋，制成5 μm 厚切片，先后进行苏木素染色和伊红染色，脱水封片，光镜下观察腓肠肌组织的病理变化。

1.5.3 TUNEL 染色 取4%多聚甲醛固定的腓肠肌组织，横切为5 μm 厚度的切片，石蜡包埋。 严格按照TUNEL 试剂盒说明书进行细胞凋亡检测。 染色结束后用抗荧光淬灭封片剂封片，置于荧光显微镜下观察并采集图像。每个切片取5 个不同视野区域，并利用Image J 软件记录阳性（绿色）细胞数及细胞总数，计算细胞凋亡率，计算公式：细胞凋亡率=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.5.4 Western blot 检测SD 大鼠腓肠肌组织中Piezo1、Bax、Bcl-2 和Caspase-3 蛋白表达 组织加液氮进行匀浆后， 加入裂解液，4 ℃，12 000 r/min 离心15 min（离心半径7 cm），收集上清液；BCA 蛋白定量法测定蛋白浓度；配制SDS-PAGE 凝胶，样品轻轻加至凝胶孔中，调制电泳仪（电压约8 V/cm）使样品通过凝胶；电泳结束后，将分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至PVDF 膜，65 V 转膜2 h；室温、摇床封闭1 h；一抗[Piezo1 抗体、Bax 抗体、Bcl-2 抗体、Caspase-3抗体、β-actin 抗体（稀释比例均为1∶1 000）]4 ℃反应过夜；二抗用TBST 稀释300倍，室温、避光缓慢摇动1 h；按1∶1 混合ECL 试剂盒中两种液体，均匀铺在PDVF 膜表面，放入化学发光成像系统获取目的蛋白条带。

1.6 统计学方法

采用SPSS 26.0 软件进行统计学处理。 计量资料均符合正态分布时用“±s”表示，组间比较用单因素方差分析，方差齐时用LSD 检验，方差不齐时选择Tamhane T2 法；不符合正态分布时选择秩和检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠平衡木测试结果比较

图1 各组大鼠平衡木时间及滑爪次数结果比较（n=8）

2.2 各组大鼠腓肠肌组织显微结构观察结果

正常组大鼠肌细胞大小均匀，排列紧密，无炎性细胞浸润；模型组大鼠大量肌细胞破裂、坏死、大小不一，排列稀疏、无规律，周围有大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润；法组大鼠肌细胞病理情况好转，有少量细胞破裂、萎缩、坏死，细胞间隔缩小，轻度局灶性炎性细胞浸润；法+抑制剂组大鼠有较多肌细胞萎缩、坏死、大小不一，排列间隔较大，周围有中性粒细胞和淋巴细胞浸润。 详见图2。

图2 各组大鼠腓肠肌组织HE 染色结果（×400）

2.3 各组大鼠腓肠肌组织细胞凋亡率比较

表1 各组大鼠腓肠肌组织细胞凋亡率比较（±s，n=8）

表1 各组大鼠腓肠肌组织细胞凋亡率比较（±s，n=8）

注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01；与法组比较，△△P<0.01。

分组正常组模型组images/BZ_117_410_2555_441_2588.png法组images/BZ_117_351_2614_382_2647.png法+抑制剂组细胞凋亡率/%2.31±1.74 43.41±25.02**10.18±9.37##39.06±19.62**△△

图3 各组大鼠腓肠肌组织TUNEL 染色（×400）

2.4 各组大鼠Piezo1、Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表达水平比较

表2 各组大鼠腓肠肌组织中Piezo1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达水平比较（±s，n=8）

表2 各组大鼠腓肠肌组织中Piezo1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达水平比较（±s，n=8）

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与法组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

分组正常组模型组images/BZ_117_1256_2288_1285_2322.png法组images/BZ_117_1256_2347_1285_2381.png法+抑制剂组Piezo1 0.43±0.06 0.30±0.08**0.40±0.05##0.33±0.06**△Bax 0.24±0.06 0.35±0.07**0.28±0.06#0.32±0.06*Bcl-2 0.34±0.06 0.22±0.07**0.31±0.06##0.26±0.05**Caspase-3 0.30±0.04 0.43±0.05**0.34±0.04##0.40±0.04**△△

图4 各组大鼠腓肠肌组织中Piezo1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白电泳图

3 讨论

骨骼肌损伤时会经历退化、炎症、再生和纤维化的连续过程[12]，过度的炎症反应和细胞凋亡不利于骨骼肌的修复和再生[13-14]，因此，抗炎与抗凋亡治疗对骨骼肌再生和促进损伤后的愈合非常重要。 推拿法是中医推拿在临床上使用极为广泛的手法之一，可产生行气活血、舒筋活络、缓解痉挛的功效，对骨骼肌损伤疗效显著[15]。 本课题组在前期研究中发现，推拿法可改善骨骼肌损伤后的炎症及纤维化情况，促进骨骼肌的修复[7-8]。Piezo1 在肌细胞和肌卫星细胞中均有表达[16]，Piezo1 的激活既可促进肌卫星细胞的分化[17]，也参与调控骨骼肌组织中的细胞凋亡过程。 有研究表明，在缺失Piezo1 的小鼠中，骨骼肌组织中促凋亡因子Bax 和Caspase-3 表达显著上调，细胞凋亡数量明显增加[18]。 基于此，本研究进一步观察Piezo1 对推拿法干预后骨骼肌损伤细胞凋亡的影响，以丰富前期研究内容。

NTX 作为一种肌肉毒素，注射入骨骼肌后可导致肌纤维的损害而不影响神经和血管，避免如挤压、撕裂中常见的缺血与纤维化的竞争性并发症，另外还可使损伤程度及范围保持一致性[19]，因而广泛应用于骨骼肌损伤模型中[9]。 平衡木测试可评价大鼠运动状态与平衡能力，因此，可用于测试骨骼肌自身损伤后的运动功能变化，以此评估骨骼肌损伤程度[11]。在本实验中，平衡木测试结果显示，相比正常组，模型组大鼠行走时间明显延长、 滑爪次数显著增多，HE 染色显示，模型组大鼠肌细胞萎缩、破裂、坏死、大小不一，排列稀疏、无规律，周围有大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润，这些提示模型组大鼠腓肠肌炎症显著，运动功能下降，损伤明显。 在推拿法干预后，腓肠肌损伤大鼠的平衡木行走时间缩短、滑爪次数减少，HE 染色显示，大鼠肌细胞病理情况相比模型组明显好转，仅有少量细胞破裂、萎缩、坏死，细胞间隔缩小，炎性细胞数量明显减少，表明推拿法可减轻骨骼肌损伤，使运动功能得以改善。

Piezo1 作为一种大型跨膜蛋白，可接受力学机械刺激，进而激活细胞内信号通路的传导[20]。有研究发现，Piezo1 可促进肌卫星细胞分化[17]和成肌细胞融合[21]，是骨骼肌再生和修复的关键调节因子。在任何可以改变膜张力的作用下，理论上都能激活Piezo1 通道，如剪切力、机械拉伸等[4]，而GsMTx4 是目前唯一已知的Piezo1 特异性抑制剂。 本实验结果发现，法+抑制剂组的行走时间和滑爪次数显著高于法组，并且从组织病理学形态结构上观察发现，法+抑制剂组的肌细胞仍有较多中性粒细胞和淋巴细胞浸润，萎缩、坏死的肌细胞占据大半。 由此可以推测，在抑制Piezo1 后，法对损伤骨骼肌的疗效有所降低，Piezo1 可能参与推拿法修复骨骼肌损伤过程。

在骨骼肌损伤重构过程中，细胞凋亡也发挥着重要作用。 如Caspases 的激活可参与肌源性分化的初始重塑阶段，并防止过度的细胞分解和随后的细胞死亡；Bcl-2 蛋白家族可通过调控线粒体凋亡信号的起始步骤，影响调节肌肉再生[22]。 Bcl-2 家族调控线粒体膜通透性，影响内源性凋亡途径，家族中Bax可促进线粒体内细胞色素C 的释放，在细胞质内与Caspase-9 形成复合物，激活与外源性通路共同介导的Caspase-3，进而促进细胞凋亡。 Bcl-2 家族中的Bcl-2 则可通过抑制Bax 而起到抗凋亡作用[23]。BARTOLI 等[18]发现，Piezo1 的缺失可上调Bax 和Caspase-3，促进骨骼肌组织中的细胞凋亡。本实验结果显示，模型组的肌细胞凋亡率明显高于正常组，且与正常组相比，模型组的Bax、Caspase-3 表达水平显著升高，Bcl-2 表达水平显著下降；而法治疗可减少腓肠肌细胞凋亡数量，升高Bcl-2 表达，降低Bax、Caspase-3 的表达，提示法对骨骼肌损伤后细胞凋亡起到抑制作用；相比法组，法+抑制剂组中细胞凋亡数量明显增加，Caspase-3 的表达显著上升，Bax 和Bcl-2 的表达水平与法组比较，虽无统计学差异，但同样有升高和下降的趋势。故本课题组推断，可能是样本量不足导致的差异无统计学意义，也可能是由于有多种共同介导Caspase-3 表达的细胞凋亡途径，除了Bcl-2 和Bax 介导的线粒体凋亡途径之外，外源性途径同样可影响终末Caspase-3来决定细胞是否凋亡。