三种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体ELISA检测方法的比较

王 幸 邱贞娜 李建丽 郁宏伟 赵玉龙 李卫东 刘 涛 裴小琴

(1 瑞普(保定）生物药业有限公司，河北保定 071000；2 河北省兽用生物制品技术创新中心，河北保定 071000；3 河南农业大学动物医学院，河南郑州 450046）

口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）感染引起的偶蹄动物共患的烈性传染病，主要通过空气进行传播[1]，临床症状主要表现为黏膜部位、四肢趾间等产生水泡、溃烂，成年动物一般死亡率较低，而幼龄动物的死亡率高达100%，感染过该病毒的动物可持续带毒，在体内存在数月或数年[2,3]，已经给世界上很多国家的畜牧业带来了严重的经济损失，我国将其列为一类动物传染病之首。

动物感染口蹄疫后机体同时产生结构蛋白和非结构蛋白抗体，而免疫动物在接触不同型病毒后，也可形成隐性感染而持续带毒[4]，如何检测隐性动物感染就成了该病防控的关键。世界动物卫生组织（OIE）规定无口蹄疫发生和接种疫苗的国家，必须证实疫苗免疫后动物血清中不产生非结构蛋白抗体[5]。目前研究发现自然感染口蹄疫病毒的动物血清中3ABC 抗体，在所有非结构蛋白抗体中持续时间最长，因而将3ABC 抗体作为鉴别口蹄疫病毒感染与免疫的指标可信度最高[6,7]。

现阶段我国主要通过疫苗免疫进行口蹄疫的防控，且常规灭活疫苗仍是当前防控使用的主要疫苗[8]。通过疫苗制备过程中去除相关的非结构蛋白，提高疫苗纯度，使免疫动物体内不产生非结构蛋白抗体，从而对自然感染与免疫动物进行鉴别诊断，也为口蹄疫防控及感染评估提供依据[9,10]。当前口蹄疫病毒诊断实验室血清学检测主要包括病毒中和试验、固相竞争酶联免疫吸附试验、液相阻断酶联免疫吸附试验和非结构蛋白ELISA[11]。

本文通过对比国内外3 家非结构蛋白抗体阻断ELISA 试剂盒，同时对瑞普公司试剂盒进行批次间差异对比，以期获得可用于区分疫苗免疫与自然感染的血清学方法，获得更高效的ELISA 检测试剂盒。

1 材料与方法

1.1 试剂盒

口蹄疫病毒3ABC 阻断ELISA 抗体检测试剂盒（试剂盒A），由瑞普（保定）公司提供；口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC 阻断ELISA 抗体检测试剂盒（试剂盒B），购自某国内厂家；口蹄疫非结构蛋白3ABC 抗体阻断ELISA 试剂盒（试剂盒C），为某进口厂家试剂盒。

1.2 血清

53 份牛血清、12 份羊血清、14 份猪血清和10 份感染后不同天数采集的牛血清。部分为质控血清样品盘、部分由内蒙古必威安泰公司提供。

1.3 仪器设备

Dnm-9606 型酶标仪为北京普朗技术有限公司产品；MIX-1500 型微孔板振荡器为杭州米欧仪器有限公司产品；微量移液器为Eppendorf 公司产品。

1.4 试验方法

试剂盒A、B、C 使用方法大体一致，按照试剂盒说明书进行操作。每孔加入80 μL 血清稀释液，然后依次加入20 μL 待测血清和阳性、阴性或弱阳性对照血清。待测样品加1 孔，阴性、弱阳性、阳性对照血清平行加2 孔，读取OD450nm值。根据公式计算测试样本阻断率（PI），PI＝（1－测试样本OD450nm值÷阴性对照平均OD450nm值）×100%。

试验成立条件：阴性对照平均OD450nm值应大于1.0；弱阳性对照血清阻断率应大于50%，阳性对照血清阻断率应大于70%。

结果判定：PI 值不低于50%时，判为口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC 抗体阳性；PI 值小于50%时，判为口蹄疫非结构蛋白3ABC 抗体阴性。

2 结果与分析

2.1 符合率试验结果

不同厂家的A、B、C 3 种试剂盒检测对比试验，阴阳性对照均成立，检测的79 份血清样本中，阳性检出率分别为56.96%、56.96%、55.7%（见表1），3 种试剂盒检测阳性血清的符合率为95.6%，同时对比瑞普公司2 批次试剂盒，2 批次检测结果完全一致。

表1 试剂盒A、B、C 的检测结果

2.2 感染后不同天数牛血清抗体水平检测试验结果

分别对感染后3 d、7 d、10 d、20 d、30 d 采集的10 份牛血清进行检测（图1、图2、图3），A、B 厂家试剂盒在感染10 d 时牛血清可检测到强阳性，C 厂家试剂盒检测感染10 d 时牛血清结果显示弱阳性，敏感性稍低于A、B 厂家试剂盒。

图1 试剂盒A 检测结果

图2 试剂盒B 检测结果

图3 试剂盒C 检测结果

3 讨论

当前疫苗免疫仍是我国防控家畜口蹄疫疫病的主要手段，近年来我国灭活口蹄疫疫苗的产品不断升级，但是对于抗原的纯净性暂未提出明确的质量要求[12]。世界动物卫生组织（OIE）在口蹄疫检测指南中明确指出，需要对疫苗中残留的非结构蛋白进行检测，以保证接种疫苗后机体不会产生非结构蛋白抗体，从而区分感染与免疫动物[6,13]。检测口蹄疫非结构蛋白抗体的ELISA 方法是现阶段鉴别自然感染与免疫的主要方法，同时对于持续感染动物的检测也较为敏感，因此，在群体净化检疫、感染状况评估等方面具有重要的应用[14,15]，筛选出高质量、稳定的非结构蛋白抗体ELISA 试剂盒对于口蹄疫防控具有重要的作用。

本试验通过使用瑞普生物、某国内厂家和某进口厂家生产的3 种同类阻断ELISA 试剂盒，同时对79 份血清样品进行ELISA 检测。结果3 种试剂盒的阳性检出率分别为56.96%、56.96%、55.7%，3 种试剂盒检测阳性血清的符合率为95.6%；同时对比瑞普公司2 批次试剂盒，2 次结果完全一致，批间稳定性良好；这3 种非结构蛋白3ABC 抗体检测试剂盒检出率差异不大，均可应用于口蹄疫鉴别诊断。同时对持续感染动物进行监测，获得非结构蛋白抗体在动物体内的消长规律，3 种非结构蛋白ELISA 试剂盒均适用于感染10 d 后样本的诊断，均可检测到抗体阳性。

4 结论

综上所述，对比的3 种非结构蛋白3ABC 抗体检测试剂盒，阳性检出率差异不大，均可应用于口蹄疫的鉴别诊断；同时3 种试剂盒均适用于感染10 d 后血清样本的诊断。3 种非结构蛋白3ABC 抗体检测试剂盒均可用于鉴别口蹄疫感染、疫苗接种以及口蹄疫感染早期的监测。