SEC61G在口腔鳞癌中的表达及其预后诊断价值

高瑞，郭磊，彭博，贾骏

0 引言

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）起源于口腔上皮组织，是最常见的颌面部恶性肿瘤。据统计，OSCC占口腔恶性肿瘤的90%以上，全球大约每年新增500 000例OSCC患者[1]，以40～60岁的男性患者多见，且其发病率随年龄的增长而上升[2]。烟、酒、槟榔等均是OSCC的致病因素，且近些年发现口腔微生物群与OSCC的发生发展密切相关[3]。OSCC具有恶性程度高、局部浸润性强、淋巴结转移率高等特点，晚期可发生远处转移，其5年生存率约55%[4-5]。尽管临床上针对OSCC的手术及放化疗等治疗方法不断改进，但其预后并没有明显的好转，仍缺乏有效的生物标志物[6]。因此，发现OSCC特异性标志物可能会提高OSCC患者的生存率，改善其预后状况。

SEC61G（SEC61 translocon subunit gamma,SEC61G）本质上是一种细胞膜蛋白，该膜蛋白是SEC61复合体的重要成员之一[7]。SEC61复合体是由SEC61α、β、γ三个亚基形成的异质三聚体蛋白通道，是细胞内质网膜蛋白转运装置的核心组件[8]。多项研究表明，SEC61G在胶质母细胞瘤[9]、胃癌[10]、肝癌[11]等恶性肿瘤中表达失调，并可作为胶质母细胞瘤的潜在预后标志物[9]。然而，SEC61G与OSCC之间的关系尚不清楚。

本研究首先利用TCGA数据库分析了SEC61G在OSCC组织和癌旁组织中的表达情况，用免疫组织化学的方法对结果进行了验证，并进一步分析SEC61G的表达与OSCC患者临床病理特性的相关性，最后探索SEC61G对OSCC的预后和诊断价值，以期为SEC61G作为OSCC诊疗的生物标志物奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究于2015—2018年在郑州大学第一附属医院口腔医院收集了64对OSCC石蜡组织及其癌旁组织。纳入标准：（1）有详细的临床病理资料，包括患者的年龄、性别、吸烟史、肿瘤位置、T分期、N分期、临床分期、淋巴结转移、组织分化；（2）术前未行放化疗，均行外科手术治疗且术后配合适当的放化疗；（3）无糖尿病等严重并发症。排除标准：（1）临床病理资料不全；（2）复发病例或术前接受过放化疗；（3）非原发于口腔颌面部的肿瘤。

1.2 TCGA数据库样本

通过TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载了OSCC患者的mRNA表达谱信息，舍弃掉没有临床信息对应的数据，共得到329例OSCC组织和32例正常组织、32对配对的OSCC组织和癌旁组织（格式：TPM，平台：RNAseq）。筛选出SEC61G的表达量和临床资料，利用仙桃学术（https://www.xiantaozi.com/）在线分析软件分析SEC61G在OSCC组织中的表达与患者N分期、临床分期、放疗史的相关性，并探讨了SEC61G的表达对OSCC的预后、诊断价值，用ggplot2[3.3.6]包对数据进行可视化。

1.3 免疫组织化学染色

采用常规免疫组织化学法检测SEC61G在OSCC组织及配对癌旁组织中的表达。具体步骤如下：在切片机上制备5 μm蜡块切片，60℃烤片2 h，24 h后4℃保存；经脱蜡、水化后，在每张切片上加50 μl的过氧化物酶阻断剂，室温条件下孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；置于1 000 ml EDTA（pH=8.0的乙二胺四乙酸）抗原修复液中修复抗原，PBS缓冲液浸泡、洗涤3次，约5分钟/次，PBST冲洗5 min；50 μl封闭液封闭，滴加一抗、二抗；显色，苏木精对比染色，梯度酒精（50%、75%、95%、100%）脱水，中性树脂封片，拍照。

染色结果的判读：由两位病理科医生采用双盲法评估，分别记录切片中SEC61G阳性细胞的比例和染色强度。染色强度分级如下：0: 未着色；1: 浅黄色；2: 棕黄色；3: 棕褐色。染色面积分级如下：0: ≤5%；1: ＞5%～25%；2: ＞25%～50%；3:＞50%～75%；4: ＞75%～100%。＜3分为SEC61G低表达，≥3分为SEC61G高表达。根据两者的得分之和判断SEC61G的表达高低。如果两名医师的判定结果不一致，则由第三名医师进行阅片并确定最终结果。

1.4 随访

对纳入的所有OSCC患者通过病历查阅、门诊复诊、电话致电的方式进行随访并记录患者的生存状态和总生存期，确保所有患者均接受3年以上的随访时间，中途失访者的生存期以最后一次随访时间为准。本研究从2016年6月开始随访，截止时间为2021年9月，每半年随访一次。

1.5 统计学方法

使用SPSS23.0版进行统计分析，所有数值均使用均数±标准差表示。卡方检验用于分析SEC61G的表达与OSCC患者临床病理特性的相关性。为了分析SEC61G的表达水平与OSCC患者预后的关系，根据免疫组织化学的结果，将64对OSCC石蜡标本分为SEC61G低表达和高表达组，并结合患者的临床随访资料，使用Kaplan-Meier法分析OSCC患者3年随访的生存资料，Log rank法比较SEC61G高表达和低表达组中OSCC患者总体生存期的差异。单因素和多因素Cox回归分析影响OSCC患者预后的危险因素。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA数据库中SEC61G在OSCC中的表达

在TCGA数据库中，SEC61G在OSCC组织中的表达明显高于正常组织（P=0.005），见图1A；在32对配对的OSCC组织和癌旁组织中，SEC61G在肿瘤组织中的表达也明显增加（P=0.003），见图1B；SEC61G在OSCC中的表达与患者T分期（P=0.047）、放疗史（P=0.036）相关，见图1C～D。此外，SEC61G在乳腺癌、前列腺癌等大多数恶性肿瘤的表达均显著增加（P＜0.05），见图1E。

图1 TCGA数据库中SEC61G在OSCC和其他恶性肿瘤组织中的表达Figure 1 Expression of SEC61G in OSCC tissues and other tumor tissues obtained from the TCGA database

2.2 免疫组织化学检测SEC61G在OSCC组织和癌旁组织中的表达

与癌旁组织相比，OSCC组织中SEC61G蛋白的阳性表达率增加，差异具有统计学意义（P=0.031）。SEC61G在低分化OSCC组织中表达最高，在高分化OSCC组织中表达最低，见图2。

图2 免疫组织化学检测SEC61G蛋白在OSCC组织中高表达Figure 2 Expression of SEC61G protein in OSCC tissues detected by immunohistochemical method

2.3 SEC61G的表达与OSCC患者临床病理特征的相关性

根据免疫组织化学的结果，分为SEC61G低表达和高表达组，并与患者的临床病理资料进行相关性分析。结果表明，SEC61G的表达与OSCC患者N分期、临床分期相关（P＜0.05），见表1。

表1 SEC61G的表达与OSCC患者临床病理特征的相关性Table 1 Relationship between SEC61G expression and clinicopathological features of patients with OSCC

2.4 SEC61G表达与OSCC患者预后不良的相关性

SEC61G低表达组中OSCC患者的总体生存率明显高于SEC61G高表达组（P=0.011），见图3A。此外，在TCGA数据库中，SEC61G低表达组中OSCC患者的总体生存期（P=0.008）、疾病特异性生存期（P=0.002）和无进展生存期（P＜0.001）均显著高于SEC61G高表达组，见图3B～D。上述结果提示，SEC61G高表达与OSCC患者预后不良有关。

图3 SEC61G高表达与OSCC患者预后不良有关Figure 3 High SEC61G expression was associated with poor prognosis of patients with OSCC

图4 SEC61G对OSCC患者的诊断价值Figure 4 Diagnostic value of SEC61G in OSCC detected in the TCGA database

2.5 Cox回归分析影响OSCC患者预后的因素

Cox单因素分析结果表明，N分期和SEC61G的表达是OSCC患者总体生存期的影响因素；多因素分析结果表明，SEC61G的表达是影响OSCC患者预后的独立因素（P＜0.05），见表2。

表2 单因素和多因素Cox回归分析影响OSCC患者预后的因素Table 2 Univariate and multivariate Cox analysis of prognostic factors for patients with OSCC

2.6 SEC61G对OSCC患者的诊断价值

在TCGA数据库中分析了SEC61G对OSCC患者的诊断意义，结果显示，ROC曲线下面积大于0.9（AUC=0.923），表明SEC61G的表达对于OSCC患者的诊断有较高的准确性，可能是OSCC的一个诊断标志物。

3 讨论

OSCC是由生物、化学、遗传等因素引起的口腔颌面部常见的恶性肿瘤，近些年发病率逐渐增高，一旦发生转移预后往往较差，严重影响患者的生命健康[12]。由于OSCC早期症状不明显，发现时多为中晚期，增加了治疗难度，病死率较高，因此早期诊断对于提高OSCC患者的生存期尤为重要。从基因水平检测与恶性肿瘤相关的蛋白或RNA，发现潜在的生物标志物，已经被证明对于提高肿瘤患者的诊疗方法、改善患者的预后状况均有重要意义[13]。

SEC61是一种内质网膜转运复合体，定位于内质网膜，对新合成的前体多肽运输到内质网至关重要[8]。除了SEC61外，由SEC62和SEC63形成的完整的蛋白质转位酶也参与蛋白质的折叠、翻译后修饰和转运[7,14]。研究表明，内质网通道蛋白与肿瘤的发生发展有关，例如SEC62和SEC63在多种恶性肿瘤中发生突变或表达异常[15-16]。然而，关于SEC61和恶性肿瘤的研究较少。SEC61G是SEC61的三个亚基之一，据报道，SEC61G在多形性胶质母细胞瘤中的表达显著增加，促进肿瘤细胞增殖，并参与内质网应激[9]。Gao等研究表明SEC61G在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且其表达水平与肝癌患者的总体生存期相关，可能是肝癌的一个治疗靶点[11]。另有研究表明，SEC61G在肾癌组织中表达失调，敲低SEC61G可促进肾癌细胞凋亡和上皮-间充质转化（EMT）[17]。Zheng等通过生物信息学分析发现SEC61G在肺腺癌中表达上调，与肺腺癌患者预后不良有关，且降低SEC61G表达可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、促进其凋亡[18]，Xu等的研究也得到同样的结果[19]。Jin等研究表明降低SEC61G表达可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、促进其凋亡，并可诱导EMT[20]。此外，Ma等研究发现SEC61G通过调节糖酵解促进乳腺癌的发生发展，可能是乳腺癌的一个潜在治疗靶点[21]。然而，SEC61G在OSCC中的作用并不清楚。

针对恶性肿瘤中差异基因的表达和预后分析，有助于发现新的肿瘤标志物。在本研究中，首先初步通过TCGA数据库分析了SEC61G在OSCC组织和正常组织中的表达，结果发现SEC61G在OSCC组织中的表达明显上调，与患者N分期、临床分期、放疗史相关，并且在前列腺癌和胆管癌等大多数恶性肿瘤中的表达均显著增高，表明SEC61G可能是一个癌基因。然后，进一步通过免疫组织化学检测了SEC61G在64例OSCC石蜡组织及其配对癌旁组织中的表达，根据其表达水平分为SEC61G高表达和低表达组，并与患者临床病理特征进行相关性分析，结果显示SEC61G在OSCC组织中的表达显著高于癌旁组织，且其表达与患者N分期、临床分期相关，再次验证了TCGA数据库的分析结果。同时，我们发现SEC61G低表达组中OSCC患者的总体生存期、疾病特异性生存期和无进展生存期均显著高于SEC61G高表达组，提示SEC61G高表达与OSCC患者预后不良有关。此外，Cox回归分析的结果显示SEC61G的表达是OSCC患者预后的独立影响因素。最后，利用TCGA数据库中的临床资料分析SEC61G对OSCC的诊断价值，结果表明SEC61G有作为OSCC诊断标志物的潜力。

综上，SEC61G在OSCC组织中高表达，且其高表达与OSCC患者预后不良有关，可能是OSCC的一个预后、诊断标志物。然而，本研究也存在一定的不足之处，比如临床样本量较少且缺乏相关的细胞功能学实验。未来可联合多中心增加临床样本量，并进一步探讨SEC61G影响OSCC发生、发展的分子机制。

利益冲突声明：

所有作者均声明不存在利益冲突。