慢性心力衰竭合并心房颤动患者血清miR-126、miR-222与心功能和主要不良心血管事件的关系

王玉巧,赵艳丽,宋梦仙,张欢,何红,王莹

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)为各种慢性心脏病基础上逐年发展为心脏疾病的终末阶段,心房颤动(atrial fibrillation,AF)是CHF患者常见的心律失常,可进一步加剧CHF患者心功能恶化,增加主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events,MACE)发生风险[1-2]。寻找可准确评估CHF合并AF患者心功能和预测MACE发生的血清标志物对预后改善至关重要。相关报道证实,炎性反应介导的心肌纤维化参与了CHF合并AF过程[3]。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miR)可通过调控多种机制参与AF发生发展[4]。miR-126是一种血管内皮特异表达miR,能通过抑制血管细胞黏附分子1表达抑制心肌炎性反应发生发展[5]。miR-126与心力衰竭和AF患者病情程度相关[6]。miR-222是一种心血管系统特异性表达miR,能通过调节多种靶基因抑制心肌炎性反应,miR-222与心力衰竭患者AF发生有关[7]。现分析CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222与心功能和MACE的关系,以期为降低CHF合并AF患者的MACE发生率提供理论依据,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020年1月—2022年10月徐州医科大学附属连云港医院心内科收治的CHF合并AF患者120例为AF组,男76例、女44例,年龄36～82(55.81±9.65)岁;CHF病程1～7(4.87±1.83)年;根据纽约心脏病协会(New York Heart Association,NYHA)心功能分级[8]:Ⅰ级22例,Ⅱ级29例,Ⅲ级26例,Ⅳ级43例;合并症:高血压37例,糖尿病28例,高脂血症18例;吸烟40例;饮酒18例。未合并AF的CHF患者100例为非AF组,男63例、女37例,年龄37～79(55.89±9.04)岁;CHF病程1～8(4.67±1.59)年。另选取医院同期体检健康者80例为健康对照组,男51例、女29例;年龄18～75(54.47±8.51)岁。3组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究已经获得医院伦理委员会批准(XYFY2019-0648),患者或家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 纳入标准:(1)CHF诊断标准参考《慢性心力衰竭基层诊疗指南(2019年)》[8]:具备心力衰竭症状和/或体征,利钠肽升高并符合以下任一条:①心脏舒张功能异常;②左心室肥厚和/或左心房扩大;(2)AF诊断标准参考《心房颤动基层诊疗指南(2019年)》[9]:经体表心电图或单导联心电记录装置记录到心房颤动心电图且持续超过30 s;(3)临床资料完整。排除标准:(1)退行性病变、器质性心脏病、遗传等非CHF导致的AF;(2)合并急慢性感染、自身免疫性疾病;(3)急性心力衰竭或慢性心力衰竭急性失代偿;(4)妊娠及哺乳期妇女;(5)精神疾病;(6)伴有恶性肿瘤;(7)肝肾功能不全;(8)先天性、风湿性心脏病所致心力衰竭。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血清miR-126、miR-222水平检测:收集患者入院次日和健康对照组体检时空腹肘静脉血3 ml,离心留取上层血清待测。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测血清miR-126、miR-222水平。具体过程如下:使用TRIzol试剂盒[购自生工生物工程(上海)股份有限公司,货号 B511321]提取血清总RNA。按照TaKaRa逆转录试剂盒(购自上海金畔生物科技有限公司,货号 RR013B)说明书将RNA逆转录为cDNA。最后使用RT-PCR系统(购自西安天隆科技有限公司,型号 Genesy 96T)并按照PCR试剂盒(购自北京百迈客生物科技有限公司,货号 RK02006)说明书进行扩增。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计、合成,以U6作为内参。内参U6上游引物5’-AGAAACACGTCTGGCTAGGAG-3’、下游引物5’-GCATGAAGGCAAGTTGGGTAG-3’;miR-126上游引物5’-TGGCAGAAAACAACCTGAACC-3’、下游引物5’-CCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG-3’;miR-222上游引物5’-TGATTGCACCCACCCTGTAG-3’、下游引物5’-GGTTCCCAGCTTTTCCGTTC-3’。反应总体积共25 μl,cDNA 1 μl、上下游引物各1 μl、2×Hieff®PCR Master Mix 10 μl、去离子水7 μl;扩增循环参数:90℃ 5 min ,90℃ 30 s、60℃ 25 s、70℃ 26 s ,共计35次。采用2-ΔΔCT法计算血清miR-126、miR-222相对表达量。

1.3.2 心功能检测:所有患者入院次日使用美国GE公司生产的Voluson E8彩色多普勒超声诊断仪行超声心动图检测,通过Simpson法测量左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD);并于入院次日采集空腹肘静脉血3 ml使用武汉明德生物科技股份有限公司提供的免疫层析法试剂盒检测N末端前体B型钠尿肽(N-terminal pro B type natriuretic peptide,NT-proBNP)水平。

1.3.3 预后及分组:CHF并发AF患者出院后通过门诊复查或电话回访的方式随访3个月,随访起始于患者出院当天,随访终止事件为随访至2023年1月或发生MACE;MACE包括再发心力衰竭入院、严重心律失常、心绞痛、心源性死亡、缺血性脑卒中、急性心肌梗死等[9]。根据是否发生MACE分为MACE亚组和非MACE亚组。

2 结 果

2.1 3组血清miR-126、miR-222水平比较 血清miR-126、miR-222水平AF组<非AF组<健康对照组(P<0.01),见表1。

表1 健康对照组、非AF组、AF组血清miR-126、miR-222水平比较Tab.1 Comparison of serum miR-126 and miR-222 levels among healthy control group, non AF group, and AF group

2.2 不同NYHA心功能分级CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222水平比较 血清miR-126、miR-222水平Ⅰ级>Ⅱ级>Ⅲ级>Ⅳ级,差异均有统计学意义(P<0.01),见表2。

表2 不同NYHA心功能分级CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222水平比较Tab.2 Comparison of serum miR-126 and miR-222 levels in CHF patients with AF and different NYHA heart function grades

2.3 AF组与非AF组心功能指标比较 AF组LVEF低于非AF组,LVEDD、NT-proBNP高于非AF组(P<0.01),见表3。

表3 AF组与非AF组心功能指标比较Tab.3 Comparison of cardiac function indicators between AF group and non AF group

2.4 CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222水平与NYHA心功能分级的相关性 Spearman相关性分析显示,CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222与NYHA心功能分级呈负相关(rs=-0.501、-0.496,P均<0.001 )。

2.5 2亚组患者临床资料比较 随访3个月,120例CHF合并AF患者发生MACE 38例(31.67%)。 2亚组患者的性别、年龄、吸烟、饮酒、合并症、用药情况、WBC、Hb、ALT、AST、SCr、BUN、血钙、血钠、APTT、LVEF、LVEDD比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。而MACE亚组患者CHF病程、NYHA分级Ⅲ～Ⅳ级、血钾、PT、NT-proBNP高于非MACE亚组,miR-126、miR-222水平低于非MACE亚组(P<0.05),见表4。

表4 非MACE亚组及MACE亚组患者临床资料比较Tab.4 Comparison of clinical data between non MACE subgroup and MACE subgroup patients

2.6 CHF合并AF患者发生MACE的多因素Logistic回归分析 以CHF合并AF患者发生MACE为因变量(赋值:是为“1”;否为“0”),以上述结果中P<0.05项目为自变量进行多因素Logistic回归分析,结果显示:NYHA心功能分级Ⅲ～Ⅳ级、NT-proBNP升高为CHF合并AF患者发生MACE的独立危险因素,血清miR-126升高、miR-222升高则为独立保护因素(P<0.05),见表5。

表5 CHF合并AF患者发生MACE的多因素Logistic回归分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis of MACE occurrence in patients with CHF combined with AF

2.7 血清miR-126、miR-222水平预测CHF合并AF患者发生MACE的效能 绘制血清miR-126、miR-222水平预测CHF合并AF患者发生MACE的效能ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示:血清miR-126、miR-222及二者联合预测CHF合并AF患者发生MACE的AUC分别为0.734、0.741、0.839,二者联合优于各自单独预测效能(用DeLong法对其差异进行比较)(Z=4.235,4.136,P=0.013,P=0.014),见表6、图1。

图1 血清miR-126、miR-222水平预测CHF合并AF患者发生MACE的ROC曲线Fig.1 ROC curve of serum miR-126 and miR-222 levels predicting MACE in patients with CHF and AF

表6 血清miR-126、miR-222水平预测CHF合并AF患者发生MACE的效能分析Tab.6 Efficacy analysis of serum miR-126 and miR-222 levels in predicting MACE in patients with CHF and AF

3 讨 论

CHF主要通过促进心肌纤维化、自主神经兴奋、心房结构重构等导致心房动作电位和自律性异常,从而诱发AF,AF会通过不规则心室节律、心房收缩丧失、心动过速、弥漫性纤维化等过程进一步降低CHF患者心功能,二者相互促进形成恶性循环加速疾病进展[1]。CHF合并AF不仅能加剧心功能恶化,同时还能降低心脏泵血功能引起心房内血流淤积形成血栓,增加急性心肌梗死、缺血性脑卒中等栓塞疾病风险,导致MACE发生率增加,导致不良预后[10]。因此,寻找与CHF合并AF患者心功能以及与MACE发生有关的血清标志物,对指导临床预防MACE发生和改善患者预后具有重大意义。

AF的发生和持续发展受到多种因素的共同影响,心肌纤维化导致的心房重构被认为是AF发生中重要病理生理机制之一,炎性反应能通过诱导心肌细胞凋亡引起心肌纤维化,再通过心房重构导致AF发生[11]。近年研究表明,miR作为一类短链非编码RNA,能通过调节神经激素、炎性反应、心房重构、电重构等机制参与AF发生发展[12]。miR-126是位于人染色体9q34.3上的一个miR,因其特异性表达于血管内皮细胞,并能通过抑制血管细胞黏附分子1表达发挥抗炎作用,通过保护血管功能发挥心脑血管保护作用,因此在心力衰竭、心肌梗死等心血管疾病中得以广泛研究[5]。既往实验指出[13],上调miR-126表达能抑制心脏肥大和心肌梗死大鼠的心肌纤维化,反之会促进心肌纤维化发展。同时有研究报道,内皮祖细胞中miR-126表达能预测CHF患者心血管疾病死亡风险[14]。miR-222是位于人染色体Xp11.3上的一个miR,特异性表达于心肌细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞等心血管系统,具有重要的心血管系统保护作用[7]。近年研究表明[15],miR-222不仅能通过抑制单核细胞趋化蛋白1、血管细胞黏附分子1等促炎因子生成发挥抗炎作用,同时还能通过抑制Wnt/β-连环蛋白、转化生长因子-β/母亲抗肢瘫同系物信号通路活化,抑制糖尿病和心力衰竭引起的心肌纤维化。Lu等[16]通过基因芯片检测发现,心力衰竭合并AF患者血浆miR-222低于心力衰竭患者。同时有学者通过生物信息学方法分析发现,miR-222有助于心力衰竭、心肌梗死等心血管疾病的预测[17]。然而关于miR-126、miR-222与CHF合并AF患者心功能和MACE的关系尚未可知。

本结果显示,CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222水平降低,这与既往研究报道结果相符[6];血清miR-126、miR-222水平随着NYHA心功能分级增加而降低,且血清miR-126、miR-222水平升高是近期MACE发生的独立保护因素。这说明血清miR-126、miR-222水平降低与CHF合并AF患者心功能降低密切相关,并且会增加CHF合并AF患者近期MACE的发生风险。分析原因可能是血清miR-126、miR-222均具有抗纤维化作用有关。血清miR-126、miR-222水平降低可使血管细胞黏附分子1等促炎因子活化,激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、Wnt/β-连环蛋白、转化生长因子-β/母亲抗肢瘫同系物信号通路,促进心肌纤维化导致AF加重,进一步减少心排血量和加重心房内血流淤积,导致心功能持续降低并增加MACE发生风险[18]。本研究结果还显示,NYHA心功能分级Ⅲ～Ⅳ级和NT-proBNP升高为CHF合并AF患者发生MACE的独立危险因素,其原因可能是NYHA心功能分级和NT-proBNP越高表示患者心功能越差,因此MACE发生风险更高。目前临床主要依靠B型利钠肽或NT-proBNP预测CHF合并AF患者预后,但其受影响因素较多,预测效能存在一定局限性。 血清miR-126、miR-222水平在0.65、0.45时预测CHF合并AF患者发生MACE的AUC为0.734、0.741,联合预测的AUC为0.839,提示联合预测较单一指标预测效能更佳。说明血清miR-126、miR-222水平可能成为CHF合并AF患者发生MACE的辅助预测指标,且联合检测血清miR-126、miR-222水平能提升预测价值。

综上所述,CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222水平下降,是MACE发生的独立影响因子,血清miR-126、miR-222水平联合预测CHF合并AF患者MACE的效能较高。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

王玉巧:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写,论文修改;赵艳丽、宋梦仙:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;张欢、何红:进行统计学分析;王莹:提出研究思路,分析试验数据,论文审核