离子交联海藻酸盐水凝胶在细胞培养和冷冻保存中的研究

李其烨 王世革 刘宝林

(1 上海理工大学生物系统热科学研究所 上海 200093;2 上海理工大学材料与化学学院 上海 200093)

随着再生医学和细胞治疗的快速发展,细胞的需求不断增加,细胞培养、储存和运输面临越来越多的挑战。传统的细胞低温保存方法是慢速冷冻和玻璃化。慢速冷冻方法通常是将细胞浸入冷冻保护剂中,通过程序降温设备设定程序降温至-80 ℃,然后将它们置于液氮中长期储存。在玻璃化保存中,细胞通常浸入较高浓度的冷冻保护剂中,并用导热系数较高的材料(如塑料麦管)封装,直接将细胞浸入液氮中储存。但高浓度保护剂对细胞的毒性显著。例如,在细胞治疗中,二甲基亚砜(DMSO)保存的细胞移植入患者体内造成严重不良反应[1-2]。因此,有必要寻找新的冷冻保存方法来降低保护剂的浓度。

近年来,海藻酸盐水凝胶作为高生物相容性的材料已被广泛应用于细胞3D培养[3-4]和冷冻中。细胞微囊化后可以保护它们免受外部环境的影响,并允许氧气和营养物质的输送[5-6]。例如,C. A. Amorim等[7]的研究表明,海藻酸钙水凝胶能够增加颗粒细胞的联系,并且可能适用于窦前卵泡的体外培养。在另一项研究中,M. M. Capeling等[8]证明海藻酸钙水凝胶可以支持人体肠道器官的体外生长并使其上皮分化。M. Matyash等[9]发现海藻酸钙水凝胶可为神经细胞提供机械支持并增加其生长能力。T. Patra等[10]发现经过海藻酸钙凝胶包封后,玻璃化组细胞的存活率显著高于包封的慢速冷冻组,包封在较小直径微胶囊中的细胞增殖速率大于包封在较大微胶囊中的细胞。此外,许多研究表明,细胞的微囊化可以显著提高冷冻保存后的存活率。例如,Yao J.等[11]通过海藻酸钙凝胶微囊化红细胞,并使用0.7 mol/L海藻糖作为冷冻保护剂进行冷冻保存,结果表明微囊化后红细胞的存活率明显高于未微囊化的细胞。在另一项研究中,Huang Haishui等[12]将小鼠胚胎干细胞和人间充质干细胞封装在海藻酸钙水凝胶中,并成功实现了用更低浓度的保护剂冷冻保存细胞。结果发现,海藻酸盐微胶囊外的溶液可以优先玻璃化,从而减缓冰晶对微胶囊内细胞的损伤。S. Saberianpour等[13]使用海藻酸盐-明胶微球对人骨髓间充质包封并用含有10% DMSO的冷冻保护剂冻存后发现微囊化的细胞可减少冻融损伤。Li C.等[14]的研究认为细胞微胶囊化可以显著抑制细胞膜上过大的气泡,减少细胞在加入低温保护剂时对细胞的渗透损伤,从而提高细胞在冷冻保存过程中的存活率。

水凝胶可以使用静电喷雾法、乳化法和微流体方法制备[10]。Lu Y. C. 等[15]采用双流体电喷雾法制备了具有核壳结构的海藻酸钙水凝胶包埋类器官,冷冻后获得比包埋在基质胶中更高的细胞存活率。S. Sivan等[16]通过乳化法制备了小尺寸海藻酸钙微胶囊包封人骨髓间充质干细胞,在体外长时间保持细胞活性。Liu Yingzhe等[17]用微流控装置合成了高度球形的海藻酸钙水凝胶,该方法制备过程具有灵活性的优点,并发现CaCl2乳液在海藻酸钠液滴周围均匀的空间分布对于获得高度球形水凝胶至关重要。海藻酸盐通常与碱金属离子如Ca2+、Ba2+[18]、Sr2+[19]交联形成水凝胶。在这些离子中,Ca2+具有较好的生物相容性,而Ba2+和Sr2+具有轻微毒性,只能使用低浓度进行细胞包埋[20]。三价离子(如Al3+、Fe3+)也可以与藻酸盐交联形成凝胶。Yang C. H. 等[21]发现与三价阳离子交联的水凝胶的机械性能明显优于二价阳离子。

与传统方法不同,本文采用低成本、易得、操作简单的空气喷涂装置制备海藻酸钙和海藻酸铁水凝胶,包封了HEK293T细胞和HepG2细胞,研究了交联过程对细胞存活影响,并成功实现了海藻酸钙水凝胶包埋细胞的体外培养,还研究了细胞包封后冷冻保存的存活率。最后,发现冷冻保存后包封细胞的存活率明显高于未包封的细胞。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

DMSO购自北京索莱宝科技有限公司。海藻酸钠、海藻糖(Tre)、柠檬酸钠二水合物、无水氯化钙、六水合三氯化铁、D-甘露醇、HEPES粉(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)购自上海麦克林生化科技有限公司。DMEM高糖培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)、乙二醇(Eg)、丙二醇(Pg)购自国药集团化学试剂有限公司。青霉素-链霉素、T25 细胞培养瓶、T75 细胞培养瓶、15 mL离心管和 50 mL离心管购自Gibco(美国)。磷酸盐缓冲液(PBS)、胰蛋白酶购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。吖啶橙/碘化丙啶双染试剂(AO/PI)购自Nexcelom(美国波士顿)。250 μL 塑料麦管购自富士平工业株式会社(日本)。0.22 μm无菌滤头购自兰杰柯科技有限公司,HEK293T细胞和HepG2细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 溶液配置

将甘露醇溶于去离子水中,制得0.25 mol/L溶液。DMEM完全培养基含有10%或20%的FBS和1%的青霉素-链霉素。通过将海藻酸钠粉末溶解于甘露醇中配置海藻酸钠溶液(1%、1.5%、2%、3%,质量分数)。通过将FeCl3·6H2O溶解在HEPES缓冲液中制备了FeCl3·6H2O溶液(0.5%、1%、2%,质量分数),将CaCl2溶解在HEPES缓冲液中制备了CaCl2溶液(0.2 mol/L)。在含有10% FBS的DMEM中制备了柠檬酸钠溶液(0.06 mol/L)。在含20% FBS的DMEM中制备了两种冷冻保护剂,cpa-1:Eg(1.5 mol/L)+Pg(1 mol/L)+Tre(1 mol/L),cpa-2:Eg(1 mol/L)+Pg(1.5 mol/L)+Tre(1 mol/L)。在含20% FBS的DMEM中制备了两种缓冲冷冻保护剂,cpa-3:Eg(0.7 mol/L)+ Pg(0.5 mol/L)+Tre(0.5 mol/L),cpa-4:Eg(1 mol/L)+Pg(0.5 mol/L)+Tre(0.5 mol/L)。在FBS中配置了冷冻保护剂DMSO(5%、10%,体积分数)。上述所有溶液均用0.22 μm无菌滤头过滤。

1.3 实验设备

实验设备如图1所示。喷壶装海藻酸钠溶液或海藻酸钠与细胞混合液并使进气口连接到气泵。喷枪有3种规格的喷嘴和喷针,直径分别为0.3、0.5、0.8 mm。液体量和液体速度均可使用气压调节旋钮进行调节。液体量也可以通过旋转喷雾调节旋钮来控制。此外,可以改变气泵的气压控制液滴大小和喷涂速度。喷嘴和喷针的规格可以改变液滴的大小,本研究中使用的喷嘴和喷针直径为0.8 mm。实验前,气泵用紫外线灭菌,喷枪用高压灭菌锅灭菌。使用扫描电子显微镜(SEM,TESCAN MIRA4)观察水凝胶的表面形貌。

1 平笔帽;2 皇冠笔帽;3 喷嘴帽;4 喷嘴;5 喷针;6 喷壶;7 气压调节旋钮;8 扳机;9 进气口;10 喷针固定螺母;11 喷涂调节旋钮。

图2 塑料麦管用于快速冷冻细胞

1.4 细胞培养

在该实验中,HEK293T细胞和HepG2细胞以相同的方式培养,均使用含有10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的DMEM培养基。用光学显微镜(尼康,日本)观察细胞形态,待细胞占满90%的视野开始实验。将废弃的培养基从T75培养瓶中轻轻吸出,用2 mL PBS洗涤两次然后吸出,再加入2 mL胰蛋白酶并在含有5% CO2的培养箱(松下健康医疗器械株式会社)中在37 ℃下孵育(HEK293T细胞1 min,HepG2细胞2 min)。取出培养瓶并轻轻敲击,用光学显微镜观察,看到大部分细胞变得圆润后,快速加入3 mL新鲜培养基停止消化,吸出细胞悬液,置于低速台式离心机中,以1 400 r/min的速度离心4 min,取一部分细胞实验,部分细胞移入T75培养瓶并加入15 mL新鲜培养基继续培养以进行后续实验。

1.5 研究交联液对细胞存活率的影响

除非另有说明,HEK293T细胞和HepG2细胞的处理方法相同。将约5×106个细胞分别加入至质量分数为0.5%、1%、2% 的FeCl3·6H2O溶液,0.2 mol/L CaCl2溶液或质量分数为2%的海藻酸钠溶液和新鲜培养基中。这些细胞被处理30 min或1 h。将细胞以1 400 r/min离心4 min,吸出上清液,加入3 mL新鲜培养基反复吹打清洗细胞,再以1 400 r/min离心4 min,吸出上清液,并加入3 mL新鲜培养基重悬。随后,取5 μL细胞悬液,再取5 μL AO/PI 双染试剂加入至细胞计数片中进行细胞染色计数(绿色荧光:活细胞,红色荧光:死细胞)。最后,将细胞计数片放入细胞计数仪中计数并计算其存活率,其余细胞移至24孔板培养24 h和48 h后进行观察。

1.6 通过喷枪将细胞包埋在水凝胶中以及水凝胶的SEM观察

细胞包埋操作如下,将1 mL 质量分数为2%的细胞海藻酸钠混合液加入至喷壶中。将CaCl2或FeCl3·6H2O溶液(50 mL)倒入1 L烧杯中,并以300 r/min的速度搅拌。将气泵气压调节至4.5 mPa后,将喷雾调节旋钮调节至最大,将气压调节旋钮拧至最紧。随后将细胞海藻酸钠混合液喷至烧杯中。每扣动扳机2 s,停止10 s以使其初步交联保持形态。将烧杯中的液体倒入 50 mL 离心管中,静置 5 min使其完全交联并自由沉降。最后,缓慢吸出溶液并加入10 mL新鲜培养基清洗水凝胶,将其转移至15 mL离心管中并以300 r/min离心2 min。离心后吸出上清液,收集用于后续实验,并取部分水凝胶用1 mL无水乙醇溶液分散,用超声充分将其混匀后,取10 μL样品滴加至剪裁好的锡纸上,放入烘箱烘干,将导电胶粘在样品台上,随后将其粘附在导电胶上,送入SEM扫描电镜中观察。

1.7 研究包埋后细胞的存活率

将2 mL柠檬酸钠溶液加入至装有包封细胞的离心管中,然后轻轻吹打以加速水凝胶的溶解并释放出包埋的细胞。将混合液以1 400 r/min离心4 min,吸出上清液以收集细胞,随后加入5 mL新鲜培养基重悬并将5 μL细胞悬液以及5 μL AO/PI 双染试剂加入细胞计数板中。将细胞计数板放入荧光细胞计数仪中以计数和测量细胞存活率。

1.8 不同质量分数海藻酸钠溶液交联CaCl2培养HEK293细胞

分别将约5×106个HEK293T细胞加入至1 mL海藻酸钠溶液(1%、1.5%、3%,质量分数)中。将CaCl2溶液(50 mL)倒入1 L烧杯中,并以300 r/min的速度搅拌,分别使用喷枪进行交联。收集的水凝胶微胶囊清洗并加入新鲜培养基,将微囊化的细胞在T25培养瓶中培养7 d,在第3天和第7天取部分水凝胶在荧光显微镜下观察。具体操作如下:将少量含有水凝胶的培养基吸出到载玻片上,并加入10 μL AO/PI双染色试剂并与包封的细胞充分混合。在明场下观察微胶囊,调整至合适视野用荧光场观察,发射波长和吸收波长分别为488 nm和520 nm。

1.9 冷冻保存微囊化的细胞并检测存活率

4种保护剂被用于快速冷冻水凝胶包裹的细胞。对于传统的DMSO保护剂,将2 mL的DMSO(5%或10%)加入至封装的细胞中,混合均匀,然后用移液枪转移至塑料麦管中。对于cpa-1和cpa-2,采用分步添加保护剂的方式,以减少在添加保护剂过程中的渗透性损伤[22-23]。将水凝胶包封的HEK293T细胞与2 mL cpa-3混合后在4 ℃冰箱中孵育10 min,并以300 r/min离心2 min。然后,吸出上清液,加入2 mL cpa-4,在4 ℃冰箱中再孵育10 min。随后,将细胞离心,吸出上清液,分别加入2 mL cpa-1和2 mL cpa-2,用移液枪吸至塑料麦管中。将塑料麦管直接放入液氮中并使之稳定。在液氮中平衡5 min后,取出塑料麦管,在37 ℃的水浴中振荡快速复温,剪断塑料麦管的末端,将水凝胶收集在15 mL的离心管中。取出部分水凝胶,在显微镜明场下观察,其余的水凝胶通过加入柠檬酸钠溶液释放细胞,并通过离心收集,将细胞重新悬浮在新鲜培养基中,检测细胞存活率。

1.10 数据分析

每组实验重复至少3次,数据以平均值±标准差(SD)表示,采用Origin2022软件中Turkey方差分析做数据分析。

2 结果和讨论

2.1 交联液对细胞存活率的影响

本文采用低成本、易得、操作简单的空气喷涂装置制备海藻酸钙水凝胶,通过SEM观察了水凝胶的表面形貌,结果如图3所示。海藻酸钙呈粗糙结构,该粗糙结构有利于细胞冻存过程中细胞与冻存液的相互作用。首先研究了交联溶液对细胞存活率的影响,图4和图5显示了HEK293T细胞和HepG2细胞在交联溶液中共培养30 min,清洗后加入新鲜培养基培养48 h后的状态。如图4(a)～(c)和图5(a)～(c)所示,在FeCl3·6H2O溶液中(图4(a)、图5(a):0.5%,质量分数;图4(b)、图5(b):1%,质量分数;图4(c)、图5(c):2%,质量分数)共培养30 min并在新鲜培养基培养48 h后,HEK293T和HepG2细胞均漂浮而未贴壁。与此形成鲜明对比的是,在CaCl2(图4(d)、图5(d):0.2 mol/L)、海藻酸钠溶液(图4(e)、图5(e):0.2%,质量分数)中共培养30 min并在新鲜培养基培养48 h后,细胞可以正常增殖,贴壁效果几乎与新鲜组(仅在新鲜DMEM培养基中处理过30 min并在新鲜培养基培养48 h后的细胞)完全相同(图4(f)、图5(f))。上述结果表明,FeCl3·6H2O可能对细胞造成明显的损伤,CaCl2和海藻酸钠溶液在实验剂量下不会影响细胞的正常生长。图6所示为经过交联液处理后细胞的存活率,其中图6(a)和图6(b)分别为HEK293T细胞和HepG2细胞在培养基(1:完全培养基;2～4:质量分数分别为0.5%、1%、2%的FeCl3·6H2O溶液;5∶0.2 mol/L CaCl2;6:质量分数为2%的海藻酸盐钠)中共同培养0.5 h及1 h后的细胞存活率。数据显示,与CaCl2共培养30 min和1 h后,HEK293T的存活率分别为89.48% ± 1.95%和84.8% ± 0.63%。与海藻酸钠溶液共培养30 min和1 h后,细胞存活率分别为94.75% ± 1.89%和91.22% ± 0.72%。与CaCl2共培养30 min的HepG2细胞在0.5 h处理后存活率为88.14% ± 1.71%,1 h后为81.025% ± 1.365%。与海藻酸钠溶液共培养30 min后细胞存活率为94.21% ± 0.59%,1 h后存活率降至91.97% ± 0.47%。

图3 2%(质量分数)海藻酸钠交联CaCl2制备的凝胶在扫描电镜下的图片

图4 培养48 h的HEK293T细胞的细胞形态

图5 培养48 h的HepG2细胞的细胞形态

图6 与交联液共培养0.5 h及1 h后的细胞存活率

上述结果表明,无论使用何种溶液,细胞存活率均会随着细胞在交联溶液中处理时间的变长而下降。因此,缩短交联时间可以提高细胞存活率。同时发现海藻酸钠溶液具有较高的生物相容性,实验剂量中CaCl2的毒性低于FeCl3·6H2O。这可能是因为高浓度的三价铁可能导致细胞线粒体损伤[24]。此外,实验分数下发现随着FeCl3·6H2O质量分数的增加,细胞存活率增加,HEK293T细胞与FeCl3·6H2O共培养0.5 h后的存活率为15.71% ± 1.42%(0.5%质量分数)、27.11% ± 1.78%(1%质量分数)和51.40%± 2.66%(2%质量分数,图6(a)),HepG2细胞的存活率为11.46% ± 1.48%(0.5%质量分数)、19.40% ± 2.07%(1%质量分数)和45.88% ± 2.28%(2%质量分数,图6(b)),具体原因仍有待进一步研究。

2.2 细胞包封后对存活率的影响

以上数据表明,交联溶液会降低HEK293T和HepG2细胞的细胞存活率,然而,在与海藻酸钠交联后可以缓解CaCl2和FeCl3·6H2O的毒性。图7(a)、7(b)分别表明了HEK293T和HepG2细胞与不同质量分数的FeCl3·6H2O以及CaCl2交联后细胞的存活率,其中(1:新鲜对照组(完全培养基);2～4:质量分数分别为0.5%、1%、2% 的FeCl3·6H2O溶液与质量分数为2%的海藻酸盐钠交联包埋细胞;5∶0.2 mol/L CaCl2与质量分数为2%的海藻酸盐钠交联包埋细胞),其中交联时间为30 min,数据表明,水凝胶包埋后的细胞存活率增加,其中不同质量分数的FeCl3·6H2O交联海藻酸钠并包埋的HEK293T细胞的存活率分别从15.705%±1.415%增至33.96%±4.36%(0.5%质量分数,P<0.001),从27.11%±1.78%增至38.66%±2.39%(1%质量分数,P<0.001),从50.13%±3.61%增至52.08%±2.63%(2%质量分数)。HepG2细胞存活率从11.46%±1.48%增至26.49%±1%(0.5%质量分数,P<0.001),从19.40%±2.07%增至33.61±3.23%(1%质量分数,P<0.001),从45.88%±2.28%增至50.61%±2.65%(2%质量分数,P<0.05)。在与CaCl2交联细胞包封的水凝胶中,交联后的细胞存活率高于约90%。使用喷枪制备的水凝胶包封细胞以及AO/PI染色的结果如图8所示,图中为包封的HEK293T细胞。a～c为以2%质量分数FeCl3·6H2O为交联溶液的水凝胶包封细胞,a为细胞包封在海藻酸铁水凝胶明场下的图片,b为包封在海藻酸铁水凝胶中的活细胞,c为包封在海藻酸铁水凝胶中的死亡细胞;d～f为以CaCl2为交联溶液的水凝胶包封细胞,结果表明,使用喷枪可以制备尺寸约为20～400 μm的水凝胶。使用AO/PI(绿色为活细胞,红色为死细胞)对微囊化细胞进行染色后,通过荧光显微镜可以发现,与FeCl3·6H2O交联后包封的细胞中的死亡细胞多于与CaCl2交联后包封的细胞中的死亡细胞,但包封后两种交联液制备水凝胶包封细胞的存活率均得到了提升,证明与海藻酸钠交联后可以缓解CaCl2和FeCl3·6H2O的毒性。以上数据表明,喷枪法制备的水凝胶可以达到良好的细胞包封效果,可能是由于高生物相容性海藻酸钠可以先包裹细胞,然后再与CaCl2和FeCl3·6H2O交联,减少了周围环境对细胞的破坏,从而保护细胞。因此,CaCl2交联的水凝胶更适合用于包埋细胞。

图7 细胞在水凝胶包封前后的存活率

图8 水凝胶包封HEK293T细胞在明场和荧光场中的观察结果

2.3 不同海藻酸盐质量分数包封HEK293T细胞并培养

在证明喷枪法制备的水凝胶可以达到良好的细胞包封效果后,选择HEK293T细胞作为代表细胞系,研究了不同质量分数海藻酸钠溶液与CaCl2交联包埋细胞后的培养效果,结果如图9所示,图9(a)、(b)、(c)分别表示质量分数为1%、1.5%、3%的海藻酸钠溶液分别与0.2 mol/L的CaCl2溶液交联包埋HEK293T细胞并3D培养3 d后的结果。对比图9(a)～(c)可知,海藻酸钠质量分数越高,水凝胶微球越均匀和规则。这可能是因为海藻酸钠的质量分数越高,液滴越容易在交联溶液中保持其形态。此外,较高的海藻酸钠质量分数可能会导致更快的交联,以此来减轻磁力搅拌对凝胶形态的破坏。如图9(a)所示,孵育3 d后,一些包封细胞的(1%质量分数的海藻酸钠)水凝胶被分解并释放包封的细胞,可能由于机械性能太低所致。相比之下,基于较高质量分数的海藻酸钠(3%质量分数)的水凝胶微球更加均匀和规则。图10为不同质量分数海藻酸钠溶液交联0.2 mol/L的CaCl2溶液封装HEK293T细胞3D培养7 d后的结果,图a～c、d～f和g～i中使用的海藻酸质量分数分别为1%、1.5%、3%。其中a、d、g为水凝胶包封细胞明场下的图片;b、e、h为水凝胶包封下的活细胞;c、f、i为水凝胶包封下的死亡细胞。培养7 d后的染色结果表明,仅有少量细胞死亡,90%以上的细胞存活,用3种质量分数的海藻酸钠包封的细胞均可以较好的在体外培养。

图9 水凝胶包封HEK293T细胞培养3 d后的形态

图10 水凝胶包封HEK293T细胞培养7 d后的形态以及荧光染色结果

2.4 冷冻保存后细胞的存活率

观察了冷冻保存后的微胶囊并检测了冷冻保存后的存活率,结果如图11所示,其中交联液为2%质量分数的海藻酸钠交联0.2 mol/L的CaCl2溶液。图11(a)所示为HEK293T细胞封装后以CPA2为保护剂冷冻保存复温后的结果;图11(b)所示为两种细胞微囊化前后在以体积分数为5%、10%的DMSO为保护剂的前提下冷冻保存的存活率,其中1～6组分别表示为:1-对照组(新鲜细胞无DMSO);2-水凝胶包封后的细胞(不含DMSO);3-水凝胶包封细胞后用10% DMSO冷冻;4-水凝胶包封细胞后用5% DMSO冷冻保存;5-新鲜细胞用10% DMSO冷冻保存;6-新鲜细胞用5% DMSO冷冻保存。图11(c)所示为新鲜细胞的存活率以及HEK293T细胞在以CPA1和CPA2为保护剂的前提下微囊化并冷冻保存前后的存活率。由图11(a)可知,冷冻保存后包封细胞的水凝胶的形态保持了良好的形态。由图11(b)可知,在无水凝胶包封的情况下,HEK293T细胞的存活率为33.16%±2.70%(10% DMSO)和16.75%±2.3%(5% DMSO)。然而,水凝胶包封后的细胞存活率增至76.51%±5.32%(10% DMSO)和60.86%±2.41%(5% DMSO)。对于HepG2细胞,经过DMSO处理的细胞的存活率从未包封前的48.93%±3.06%(10% DMSO)和36.22%±2.54%(5% DMSO)增至包封后的78.79%±4.43%(10% DMSO)和64.64%±3.13%(5% DMSO)。可以看出,水凝胶包封后冷冻细胞的存活率明显提高。由图11(c)可知,在保护剂CPA-1和CPA-2中玻璃化冻存微囊化的HEK293T细胞后,也发现了相同的结果。在CPA-1中,HEK293T细胞在微胶囊化前的存活率为47.24%±2.15%,微胶囊化后为56.71%±2.35%。在CPA-2中,水凝胶微胶囊化后HEK293T的存活率从33.5%±0.8%增至79.05%±3.76%。显然,水凝胶包封后冷冻保存的HEK293T细胞的存活率显著提高,进一步表现了水凝胶在细胞冻存中对细胞的保护作用。

图11 微囊化的细胞低温保存后的图片以及存活率

3 结论

为了探究更快的方法制备海藻酸盐水凝胶包埋细胞并探究水凝胶在细胞培养及低温保存中的优势,选用喷枪设备制备了海藻酸钙与海藻酸铁凝胶包封了HEK293T和HepG2细胞,得到如下结论:

1)在交联液与细胞共同培养的实验中论证了随着时间延长,细胞存活率下降,Fe3+会对细胞造成不可逆损伤,Ca2+的生物相容性好很多。同时发现凝胶后显著降低了细胞在交联液中的毒性。

2)采用喷枪设备将HEK293T细胞封装在不同质量分数的海藻酸钠制备的海藻酸钙凝胶中培养7 d,发现该方法制备的水凝胶不会影响微囊化细胞的培养。

3)在微囊化后细胞的冻存实验中,发现水凝胶包封后在以DMSO为保护剂的快速冷冻保存,以及使用乙二醇(1 mol/L)+丙二醇(1.5 mol/L)+海藻糖(1 mol/L)的玻璃化保存中均对细胞有显著的保护效果,再次证实了该方法用于细胞包埋、细胞培养及冻存的可行性。

关于喷笔制备水凝胶提出以下展望,该方法成本低,操作简单,可以更快地包封细胞,并且可以通过减少交联时间来降低细胞损伤。缺点是需要人工操作,制备的水凝胶大小不一,可以考虑采用自动化设备来解决这一问题。