猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

于浩洋，王彩霞，仇松寅，刘晓飞，景宏丽，吴绍强，冯春燕，林祥梅

（1.中国检验检疫科学研究院动物检验与检疫研究所，北京 100176；2.三亚中国检科院生物安全中心，海南三亚 572000）

猪Linda病毒（Linda virus，LV）是黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的新成员。瘟病毒属病毒为高度可变的RNA 病毒，病毒粒子包含4 个结构蛋白和8 个非结构蛋白[1]。在国际病毒分类委员会（ICTV）第十次报告中，瘟病毒属被划分为11 个种（PestivirusA—K），具体包括牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型（bovine viral diarrhea virus 1，BVDV-1）、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型（bovine viral diarrhea virus 2，BVDV-2）、猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、边界病病毒（border disease virus，BDV）、叉角羚羊瘟病毒（pronghorn antelope pestivirus，PAPeV）、Bungowannah 病毒（Bungowannah virus，BV）、长颈鹿瘟病毒（giraffe pestivirus，GPeV）、Hobi 样瘟病毒（Hobi-like pestivirus，HoBiPeV）、Aydin 样瘟病毒（Aydinlike pestivirus，AydinPeV）、 大鼠瘟病毒（rat pestivirus，RPeV）、猪非典型瘟病毒（atypical porcine pestivirus，APPV）[2]。该属中的CSFV、BV、APPV 与LV 都可引起猪相关疾病，给全球养猪业造成了巨大经济损失。其中BV、APPV 与LV均为近20年来发现的新型瘟病毒。2003年，澳大利亚猪只暴发了可导致母猪生殖障碍，产死胎、木乃伊胎以及断奶仔猪猝死的疫病，2007年其病原被命名为BV[3-4]。2015年，APPV 被发现，其能够引起仔猪先天性震颤（congenital tremors，CT），在全球范围内均有流行[5]。同年，Benjamin 等[6]从奥地利一家猪场的感染猪中分离出一种新型瘟病毒，将其命名为Linda病毒。研究[7]显示：感染LV 后，该猪场中20%～100%仔猪表现出严重的全身侧摇及吮吸母乳困难，且仔猪断奶前死亡率很高；对患病仔猪进行组织病理学检查，确认其为A-II 型CT，患病仔猪脊髓髓鞘退化严重，中枢神经系统（CNS）组织中存在病毒抗原。虽然LV 与APPV 均会导致CT，但瘟病毒属亲缘关系研究[8]显示，LV 与BV 的亲缘关系最近，而与APPV 基因同源性仅为60%。另一项研究[9]显示，免疫功能正常的仔猪感染LV 后可出现短暂的病毒血症，在感染后14 d 表现出强烈的体液免疫反应，并产生高滴度的LV 中和抗体，且病毒能够持续存在于仔猪淋巴组织中，21 d 后仍可被检测到。LV 感染疫情首次在奥地利发生后并没有造成广泛传播，仅在距离首次发生疫情农场10 km 以外的另一农场中被监测到，该农场仔猪同样出现了CT 症状和死亡，同时在感染仔猪的粪便和唾液中检出大量病毒，推测这可能是LV 的传播途径[10]。目前我国尚无LV感染病例，关于LV 的检测方法也较少，仅有本实验室建立的荧光RT-PCR 方法[11]，而储备有效快速的检测方法是预防该疫病传入的有效手段。

巢式PCR 是使用两套引物进行PCR 扩增的方法，相较于普通PCR，它具有更高的特异性和灵敏度[12]。此外，巢式PCR 是一种传统的PCR 技术，对设备、人员及成本要求不高，适用于条件有限的养殖场及实验室。本研究针对LV 保守序列Core-Erns基因，首次建立了巢式RT-PCR检测方法，以期对LV 进行准确、快速检测，从而为口岸预防该病传入及国内养殖场对疫病检测提供技术储备。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

灭活的非洲猪瘟病毒（African swine fever，ASFV）阳性血清，由波兰国家兽医研究所提供；CSFV 活疫苗，购自武汉科前生物股份有限公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）活疫苗，购自哈药集团生物疫苗有限公司；猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）活疫苗（Kartha-K61株），购自青岛易邦生物工程有限公司；猪圆环病毒2 型（porcine circovirus type 2，PCV2）灭活疫苗，购自哈尔滨维科生物技术开发公司；DNA 提取试剂盒（QIAamp®Viral DNA Mini Kit）、RNA提取试剂盒（QIAamp®Viral RNA Mini Kit），购自德国QIAGEN 公司；2×PCR ExTaq聚合酶，购自日本TaKaRa 公司；一步法移除gDNA 并合成cDNA 混 合 液（TransScipt II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix），购自北京全式金生物技术股份有限公司；聚乙二醇8000（PEG 8000），购自美国Sigma 公司；pLVX 载体、包膜质粒、包装质粒、293T 细胞等，均由中国检验检疫科学研究院保存；Core-Erns基因靶标序列，由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

PCR 仪（Veriti96），购自美国ABI 公司；台式冷冻离心机（Microfuge20R），购自美国BECKMAN COULTER 公司；电泳仪（DYY-6C 型），购自北京六一生物科技有限公司；迷你紫外投射切胶仪（M-10E），购自美国UVP 公司；凝胶成像仪（Fluor Chem E），购自美国protein simple 公司。

1.2 引物设计

针对靶序列，引物位置的选择对PCR 建立至关重要。使用Mega 7.0 软件对瘟病毒属病毒Core-Erns基因序列进行分析，确认各病毒的亲缘关系，并绘制遗传进化树。随后下载GenBank 中所有LV 毒株序列（OK086026.1、MZ027894.1、NC_035432.1 与KY436034.1）及同属病毒代表毒株序列，包括BVDV-1（M31182.1、KX577637.1）、BVDV-2（U18059.1、FJ527854.1）、CSFV（X87939.1、J04358.2）、BDV（AF037405.1）、PAPeV（AY781152.3）、BV（NC023176.1、MH807263.1、EF100713.2）、GPeV（AF144617.2）、BVDV-3（AB871953.1）、AydinPeV（NC018713.1）、RPeV（KJ950914.1）、APPV（KX929062.1、KU041639.1、KU194229.1）。 对上述毒株的Core-Erns基因序列进一步比对分析，选取LV 与其余瘟病毒有差异的Core-Erns基因区域来设计引物。

1.3 RNA 慢病毒粒子核酸定性阳性对照样品制备

将人工合成的Core-Erns基因靶标序列克隆至慢病毒pLVX 载体，然后将重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染至293T 细胞；48 h 后收集含有慢病毒颗粒的细胞上清，加入PEG 8000，混匀后置于4 ℃过夜；对混合液进行浓缩与纯化，然后以PBS 轻轻重悬，获得含有靶标基因的慢病毒粒子；按照RNA 提取试剂盒说明书提取慢病毒RNA，并根据一步法合成cDNA 试剂盒说明书，将慢病毒RNA 反转录为cDNA，计算cDNA 拷贝数并作为模板待用。

1.4 巢式RT-PCR检测方法的建立与优化

按照2×PCR ExTaqPCR 试剂盒说明书提供的反应体系与条件，分别对一轮RT-PCR 与二轮巢式RT-PCR 的模板用量、退火温度、引物浓度等进行优化，确定最佳扩增条件。

1.5 敏感性试验

以10 倍倍比稀释的慢病毒阳性对照品cDNA（106～100copies/μL）作为模板，无酶水作为阴性对照，进行巢式RT-PCR检测，验证所建立方法的灵敏度。

1.6 特异性试验

按照DNA 提取试剂盒说明书，提取PCV2灭活疫苗、ASFV 阳性血清、PRV 活疫苗DNA；再按照RNA 提取试剂盒说明书，分别提取灭活CSFV 活疫苗、PRRSV 活疫苗RNA，并反转录为cDNA。分别以上述DNA、cDNA 样品作为模板，同时以慢病毒阳性对照品cDNA 为阳性对照，无酶水为阴性对照，进行巢式RT-PCR检测，验证所建立方法的特异性。

1.7 重复性试验

以慢病毒阳性对照品cDNA（106copies/μL）为模板，重复3 次试验，进行组内巢式RTPCR 检测；然后以慢病毒阳性对照品cDNA（106copies/μL）为模板，每隔1 周进行1 次试验，共3 次，进行组间巢式RT-PCR检测，验证所建立方法的重复性。

1.8 对病毒模拟样品的检测限及与荧光RT-PCR灵敏度比较

病毒模拟样品制备：参照文献[13]中的方法，计算1.3 中LV RNA 慢病毒粒子滴度，并对慢病毒粒子进行10 倍倍比稀释（106～100TU/mL）；将不同浓度梯度的慢病毒粒子分别与猪阴性血清混合，制备病毒模拟样品。提取病毒模拟样品RNA，并反转录为cDNA。利用本研究建立的巢式RT-PCR与本实验室前期建立的荧光RT-PCR 方法[11]，分别对病毒模拟样品进行扩增，评估巢式RT-PCR 对病毒模拟样品的检测限，并比较上述两种方法的灵敏度。

2 结果

2.1 靶序列选择及引物设计

利用Mega 7.0 软件对瘟病毒属病毒Core-Erns基因进行进化分析。以LV 为树根绘制的进化树（图1）显示，LV 与BV（NC023176.1、EF100713.2）亲缘关系较近，与其余瘟病毒亲缘关系较远。进一步对瘟病毒Core-Erns基因靶序列比对分析的结果（图2）显示，LVCore-Erns基因靶序列（1 030～1 664 bp）为一段高度保守序列。针对该靶序列，使用Oligo7 软件设计两对套式引物，外套引物为LINDA-N-F1、LINDA-N-R1，内套引物为LINDA-N-F2、LINDA-N-R2。引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。引物序列见表1。

表1 引物序列

图1 瘟病毒属病毒Core-Erns 基因进化关系

图2 瘟病毒属病毒Core-Erns 基因靶序列比对结果

2.2 巢式RT-PCR 反应体系建立

经过对模板用量、退火温度和引物配比等优化，最终确定了LV 一轮RT-PCR 扩增反应体系：2×ExTaq10 μL，LINDA-N-F1（10 μmol/L）1 μL，LINDA-N-R1（10 μmol/L）1 μL，LV 慢病毒阳性对照品cDNA（作为模板）1 μL，最后以ddH2O 补充至20 μL。扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，进行35 个循环；72 ℃延伸8 min。

LV 第二轮巢式RT-PCR 扩增反应体系：2×ExTaq10 μL，LINDA-N-F2（10 μmol/L）1 μL，LINDA-N-R2（10 μmol/L）1 μL，100 倍稀释的一轮PCR 产物（作为模板）1 μL，最后以ddH2O 补充至20 μL。扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，进行35 个循环；72 ℃延伸8 min。

2.3 敏感性试验

以10 倍倍比稀释的LV 慢病毒阳性对照品cDNA（106～100copies/μL）为模板，进行巢式RTPCR 检测。结果显示，第一轮RT-PCR 可检测到102copies/μL 的慢病毒阳性对照品cDNA（图3-A）；以100 倍稀释的第一轮RT-PCR 扩增产物作为巢式RT-PCR 模板，第二轮巢式RT-PCR可检测到101copies/μL 的慢病毒阳性对照品（图3-B）。结果表明，巢式RT-PCR 灵敏度为普通RTPCR 的10 倍，其对LV 慢病毒阳性对照品的最低检出限为101copies/μL。

图3 敏感性试验结果

2.4 特异性试验

以CSFV、PRRSV cDNA 以及PCV2 ASFV 及PRV DNA 样品为模板，慢病毒阳性对照品cDNA为阳性对照，无酶水为阴性对照，进行巢式RTPCR 特异性试验。结果（图4）显示，只有泳道1（LV慢病毒阳性对照品）有目的条带，其余泳道均没有条带。结果表明，本研究建立的巢式RT-PCR 方法具有良好的特异性。

图4 特异性试验结果

2.5 重复性试验

以慢病毒阳性对照品cDNA（106copies/μL）为模板，进行组内与组间巢式RT-PCR检测。结果（图5）显示，组内与组间各3 次巢式RT-PCR检测均为单一目的条带。结果表明，该方法具有良好的重复性。

图5 重复性试验结果

2.6 病毒模拟样品检测及与荧光RT-PCR 灵敏度比较

制备不同梯度的病毒模拟样品（106～100TU/mL），提取其cDNA 作为模板进行巢式RT-PCR 与实时荧光RT-PCR检测。结果（图6）显示，实时荧光RT-PCR 与巢式RT-PCR 的检测灵敏度一致，对病毒模拟样品的最低检出限均为101TU/mL。

图6 两种方法对病毒模拟样品的检测结果

3 讨论

CT 是一种主要危害新生仔猪的疾病。轻微感染的仔猪表现为耳朵、侧翼或后腿区域明显震颤；严重感染时，仔猪在出生数小时内发生局部或全身肌肉痉挛，甚至出现全身持续震颤从而站立或行走困难，无法哺乳进食，最终被饿死[14]。CSFV、APPV 与LV 等病毒感染是仔猪CT 发生的原因之一。从病理角度CT 可分为可见组织学病变的A 型与未见明显病变的B 型。A 型CT 可进一步分为5组，分别为A Ⅰ—A Ⅴ：A Ⅲ和A Ⅳ型与某些猪品种的遗传相关；A Ⅴ型是由母猪妊娠期间有机磷化合物中毒引起；A Ⅰ和A Ⅱ型都是由病毒感染引起，其中A Ⅰ型是由感染CSFV 的母猪经胎盘传播引起，而A Ⅱ型是由APPV 或LV 等病毒感染引起[3，14]。自2015年APPV在美国被首次发现以来，全球多个国家均有该病毒的相关报道，其血清阳性率可达到60%，而LV 疫情仅在奥地利出现2 次，并未造成大范围传播[7-10]。

目前LV 毒株序列及其相关研究均较少，且未在我国发现感染病例。因LV 与APPV 感染后引起的临床症状高度相似，均能引起仔猪发生CT，因此当感染发生时，无法根据症状来分辨感染病原，需要进一步进行分子生物学鉴别诊断。我国已有多篇文献报道建立了APPV 的PCR 与qPCR 检测方法[5]，但LV 的病原学检测方法较少，仅有本实验室前期建立的荧光RT-PCR 方法。因而储备灵敏度高、特异性好的LV 检测方法对预防LV 传入我国十分重要。

本研究针对LVCore-Erns基因靶序列建立了巢式RT-PCR 方法。结果显示：该方法对RNA慢病毒粒子核酸定性阳性对照品的最低检出限为101copies/μL，灵敏度为普通RT-PCR 的10 倍。该方法显示出良好的特异性，与ASFV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2 均无交叉反应；用该方法对病毒模拟样品进行检测，最低检出限为101TU/mL，与本实验室建立的实时荧光RT-PCR 方法灵敏度一致[13]。由于巢式RT-PCR 方法成本更低，且仅需PCR 仪便可完成检测，因此在条件有限的检测机构依然可以进行，这为口岸或条件有限的猪场现场筛查LV 提供了有效的技术手段。