基于高通量测序技术的9种铁线莲属药材混合粉末分子鉴定

呼和,莫日根,乌雅汉,乌日汗,额尔敦呼,3,白明君,包桂花,4,许亮

(1.内蒙古民族大学,内蒙古 通辽 028000;2.新巴尔虎右旗阿拉坦额莫勒镇社区卫生服务中心,内蒙古 呼伦贝尔 021300;3.内蒙古自治区国际蒙医医院,内蒙古 呼和浩特 010020;4.蒙医药研发工程教育部重点实验室,内蒙古 通辽 028000;5.辽宁中医药大学,辽宁 大连 116000)

铁线莲属植物在全世界有300多种,主要分布在热带及亚热带地区,寒带地区也有分布。我国约有108种,广泛分布于全国各地,云南是我国铁线莲属植物的分布中心[1-2]。铁线莲属植物适应性强,具有较强的耐寒性,该属许多种类花大色艳,花色各种各样,花型多种,花期长,观赏价值很高,具有“攀援植物皇后”的美称[3]。铁线莲属植物是我国传统中草药,具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、镇痛等作用[4],目前国内外对铁线莲属的研究主要在生理抗性、无性繁殖、化学成分和药理作用等方面[5]。铁线莲属植物在我国29个少数民族地区作为民族药使用,其药用部位多以根和全草为主,其次是藤茎,叶较少,另有个别药材用带花枝叶、果实、嫩枝或根皮[6]。民族药传统功效为祛风止痛、利尿通淋、痛经下乳、抗菌消炎等,少部分可用于消化不良、胃寒、腹胀、黄疸、痞块、心悸、鼻窦炎等病症治疗;外敷可用于疮疡久溃不敛、皮肤炎症,如羌族用黄花铁线莲嫩枝外敷治各种顽癣、神经性皮炎。毛茛科铁线莲属近缘物种化学成分、药理作用相似,如短尾铁线莲、芹叶铁线莲、黄花铁线莲等[7]。在市场流通过程中,经常有近缘药材代替正品药材的现象,严重影响了临床用药的安全性和准确性,应引起广泛重视。因此,为了临床用药安全性及有效性,准确鉴定铁线莲属近缘药材任重而道远。

有关铁线莲属药材的分子鉴定研究较少,传统的鉴定方法不能很好地对正品、伪品药材进行准确系统的鉴定。近年来,分子鉴定技术不断发展,越来越多的学者利用分子技术对近缘药材进行鉴定,并具有一定的可行性。因此,分子鉴定的相关研究越来越多,研究成果也较为突出。安蕊等[8]利用聚合酶链反应-单链构象多态性方法,建立了一种快速、准确鉴别威灵仙药材基原的方法,为进一步开展威灵仙药材的准确鉴定提供了新的方法。木其尔[9]应用DNA 条形码技术,对14种铁线莲属植物进行了分子鉴定,为 DNA 条形码技术鉴别铁线莲属药材提供了新的思路。高通量测序技术作为新一代的测序技术,广泛用于中药材的鉴定,并且能够应用于药材混合粉末样品的鉴定[10]。

本实验利用高通量测序技术,对棉团铁线莲、女萎铁线莲、短尾铁线莲、灌木铁线莲、单叶铁线莲、黄花铁线莲、粗齿铁线莲、东北铁线莲和芹叶铁线莲等9种铁线莲属药材混合粉末样品的 ITS2 序列进行宏基因组学物种多样性分析,并构建系统发育树,旨在鉴定出混合粉末样品中的铁线莲属药材,同时探究其系统进化关系。

1 材料

1.1 药材9种铁线莲属药材采集时间为2022年7月至2022年9月,其药用部位均为全草,样品信息见表 1。

表1 样本信息

1.2 试剂天根植物提取试剂盒、DNA Taq聚合酶、2 000 bp DNA Marker(Takara公司);溴化乙锭(Fluka公司),1×TAE缓冲液(Solarbio公司);引物(北京六合华大基因科技有限公司);ddH2O和 Q5DNA聚合酶(北京康为世纪生物科技有限公司);反应buffer、GC buffer 和 dNTP(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 仪器微量移液器(Eppendorf公司);Sigma 3K15低温冷冻离心机(北京五洲东方公司);MultiGene Gradient PCR仪(Labent InternationL Ine);DYY-12 电泳系统(北京市六一仪器厂);QUA NTUM凝胶成像分析仪(北京五洲东方公司)。

2 方法

2.1 样品总DNA提取取9种药材各3 g,分别研碎,等比混匀,取3份100 mg混合粉末样品分别命名为TXL1、TXL2、TXL3。应用植物提取试剂盒提取样品中总DNA。

2.2 PCR扩增混合样品宏基因组物种多样性分析,目标为ITS2序列片段,引物序列为ITS2:5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′,5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。扩增体系为 25 μL:5×反应 buffer 5 μL,5×GC buffer 5 μL,dNTP 2 μL,上游引物和下游引物各1 μL,DNA 模板 2 μL,ddH2O为 8.75 μL,Q5DNA聚合酶0.25 μL。扩增参数:96 ℃预变性3 min,96 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30 个循环,72 ℃延长5 min。

2.3 测序文库制备采用Illumina MiSeq平台进行双端测序。采用滑动窗口法筛查 FASTQ 格式的双端序列质量。利用FLASH软件[11]对通过质量初筛的序列进行配对连接。将连接后的序列识别分配入对应样本,获得有效序列。使用QIIME(使用的QIIME为QIIME22019.4官方网址是https://docs.qiime2.org)和UCLUST(Vsearch版本为v2.13.4_linux_x86_64)软件。具体的参数为:首先使用cutadapt切除序列的引物片段,设置-O为10,弃去未匹配引物的序列[12];使用Vsearch的fastq_mergepairs模块拼接序列;使用fastq_filter模块对拼接序列进行质控;使用 derep_fulllength模块去除重复序列;使用cluster_size模块,在98%相似度水平对去重后的序列聚类,使用uchime_denovo模块去除嵌合体;再使用perl脚本(https://github.com/torognes/vsearch/wiki/VSEARCH-pipeline),过滤质控后序列集中的嵌合体,从而获得高质量序列;使用cluster_size模块,在97%相似度水平对高质量序列聚类,并分别输出代表序列和OTU表。最后,去除OTU表格中的singletons OTUs(即在所有样本中丰度为1的OTU,默认操作)及其代表序列[13]。利用UNITE[14]和NCBI数据库进行序列比对,获取各OTU的分类学信息。

2.4 分类学信息交互展示与进化分析使用Krona软件(https://github.com/marbl/Krona/wiki)进行群落分类,并对样本分类水平的组成进行可视化分析。并使用MEGA 7.0 在NCBI下载的序列与OTU代表序列构建邻接系统分类(NJ)树,鉴定出物种并探讨系统进化关系。

3 结果与分析

3.1 测序结果混合粉末样品的物种多样性分析显示,3组重复实验TXL1、TXL2、TXL3分别得到113 671、131 403、138 206条序列,所得序列总数为383 280条。剔除有疑问的序列后,剩余高质量的序列总数为257 435条,其中TXL1为72 451条、TXL2为95 553条、TXL3为89 431条,序列长度为363 bp和364 bp的序列条数最多,分别为164 262条和1 077条。

3.2 分类学组成分析根据 OTU 划分及分类比对3组混合样品,样品共得到496个OTU,共包含123 533条序列。样品总体的OTU划分和分类地位鉴定结果见表2,可以获得各样本在各分类水平的具体组成。分类结果与 GenBank下载的参考序列进行比对,有72个OTU比对到混合粉末样品中的7个物种,分别为棉团铁线莲、女萎铁线莲、短尾铁线莲、灌木铁线莲、单叶铁线莲、黄花铁线莲、粗齿铁线莲,共有46 459条ITS2 序列。但混合粉末样品中的其他2种药材,东北铁线莲和芹叶铁线莲未能比对出来。可能是由于其2个物种在储藏过程中DNA降解,较低的DNA含量不利于物种的鉴定导致。此外,还有可能的原因是碱基错配、组装偏差、测序深度不够等问题。

表2 OTU 划分和分类统计表

3.3 基于Krona分类学组成信息交互展示和系统发育树的构建

3.3.1 基于Krona分类学组成信息交互结果采用Krona软件(https://github.com/marbl/Krona/wiki)进行群落分类学组成的交互展示,可以对样本分类学组成进行可视化分析,同时也能展示数据的交互关系。粉末样品中被注释到的物种均为毛茛科铁线莲属物种,铁线莲属为优势类群,丰度值达到了 100%,未有其他物种被注释,结果见图1。这一结果与混合粉末样品中的物种实际情况相符。但实际上,基于宏基因组学物种多样性分析技术,除了本研究侧重考虑铁线莲属物种外,微生物物种也可能被鉴定出,但在测序结果中并未观察到。而在分类学组成分析中,未分类的 OTU 单元数量很多,还有一些 OTU 未被注释,因此,这些未被分类或注释的物种可能为微生物物种。通过构建 Krona 的分类学组成信息交互展示图,能很好地反映样品中物种的实际分布情况。

图1 基于Krona分类学组成信息交互展示图

3.3.2 系统发育树使用MEGA7.0软件,从NCBI中选取鉴定出7种物种的ITS2序列,并与OTU代表序列构建NJ树。鉴定出棉团铁线莲、女萎铁线莲、短尾铁线莲、灌木铁线莲、单叶铁线莲、黄花铁线莲、粗齿铁线莲聚为一支,且可信度良好。其中,共含有12个节点,可信值为100%的节点有3个,可信值在80%以上的节点有2个,可信值在75%以上的节点有3个,可信值在70%以上的节点有4个,结果见图2。系统进化分析鉴定出7种同属不同物种,同时体现了物种的亲缘关系,为铁线莲相关物种的系统进化研究提供了理论依据。

DWTXL:短尾铁线莲(Clematis brevicaudata DC.);DYTXL:单叶铁线莲(Clematis henryi Oliv.);CCTXL:粗齿铁线莲(Clematis argentilucida Levl.et Vant);GMTXL:灌木铁线莲(Clematis fruticosa Turcz.);HHTXL:黄花铁线莲(Clematis intricate Bunge);NWTXL:女萎铁线莲(Clematis apiifolia DC.Syst);MTTXL:棉团铁线莲(Clematis hexapetala Pall.)

4 讨论

近年来,宏基因组学分析技术在药材的鉴定中被广泛应用,尤其以分子生药学为基础的分子鉴定技术,越来越受到中药学者的关注。目前,蒙药均以原粉入药,利用传统的鉴定方法不能准确地将他们区分。本研究采用高通量测序技术[15-16],利用 ITS2 序列作为 DNA 条形码,对铁线莲属9种药材的混合粉末进行物种鉴定,该方法具有准确性高、重复性好等特点。

本研究首次将该分析方法应用于铁线莲属9种药材混合粉的鉴定,鉴定出混合样品中的7种物种,但未能鉴定出混合粉末样品中的其他2种药材,并且3个重复组9个样品试验结果均未鉴定出东北铁线莲和芹叶铁线莲。可能与样品的储藏、测序、碱基错配、组装等有关联。

在OTU 划分和分类统计表中,从界到属的数据不是一直增大,由于有一些分类学水平没有明确的注释,所以不参与计数。例如一条序列在数据库中科水平有明确的注释,但是在属水平没有明确注释,所以会出现属水平小于科水平的数量。

测序结果表明,363 bp和364 bp的序列条数最多,分别为164 262条和1 077条。这两个序列的长度值分布的序列数量远高于其他序列长度所分布的序列数量。分类学组成分析中,还有一些未被注释的OTU,样品中存在一些物种未能被鉴定出来,这些物种可能为样品中存在的细菌和真菌等微生物物种。在高通量测序过程中虽然被测出,但未能被分类或注释。这种现象的产生可能与 ITS2 引物的偏好性、 测序深度等有关,也可能是因为这些微生物物种所得的 OTU 数量极低,在后续分析过程中当作背景噪音而清除,因此,未能准确注释。在 Krona 的分类学组成信息交互展示图中表示黄花铁线莲序列占有效序列总量的22%、单叶铁线莲19%,短尾铁线莲占28%,女萎铁线莲占10%,灌木铁线莲占7%,棉团铁线莲占13%,粗齿铁线莲占1%,还有未能比对出东北铁线莲和芹叶铁线莲。可能是因为测序及分析技术本身存在不足,组装偏差、碱基错配、测序深度不够等,这些因素可能将不同药材物种的OTU进行了归并,致使未能准确鉴定。也可能与每个物种含有DNA的质量或提取效率有关,较低的DNA含量和提取效率不利于实验结果的体现;系统发育树分析进一步验证了所比对到的各个物种,从Genbank中选取鉴定出的7种物种的ITS2序列,与OTU代表序列相符合,他们之间的系统进化关系更近。因此,混合样品物种的鉴定得到了验证,测序结果更具有说服力。高通量测序技术有利于对中蒙药材的准确快速鉴定,可满足不同行业人员对中蒙药材鉴定的需求,并对临床用药安全提供坚实基础。