盐酸四环素长期暴露对序批式反应器性能、微生物酶活性及微生物群落的影响*

齐维毅, 王倩芝, 楚光玉, 陈文正, 张雨乔, 刘甲滕, 高 畅, 鲁帅领, 高孟春**

(1. 中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室, 山东 青岛 266100; 2. 中国海洋大学环境科学与工程学院, 山东 青岛 266100)

随着水体污染和水体富营养化问题的日益突出,污水处理技术逐渐从过去以单一的有机物去除,转变为碳、氮和磷的同步削减。化学除磷具有良好的去除效果,现已在实际处理工程中普遍应用,而氮的去除仍需通过生物法。因此,生物脱氮工艺仍为当今污水处理领域的研究热点之一[1]。传统生物脱氮工艺主要包括硝化和反硝化过程,实际工程中,由于功能不同的微生物生理代谢特征具有差异性,为了弥补传统生物脱氮工艺的不足,故衍生出序批式活性污泥法(Sequencing batch reactor,SBR)处理技术,SBR技术具有脱氮除磷效果好、抗冲击能力强等特点,目前已在国内外获得广泛应用。SBR具有明显的工艺优势和广阔的应用前景,稳定的生物活性是其优势发挥的重要前提。溶解氧、温度、pH值、有机负荷、进水碳氮比和含毒性物质(如抗生素和重金属)等进水水质特征均会影响SBR活性污泥的微生物活性,进而影响其对污染物的去除性能[2]。

四环素类抗生素是一种广谱抗菌剂,广泛应用于医学和畜牧业等行业。由于生物对其利用率较低,导致大量含四环素的医疗和养殖废水进入污水处理厂。四环素类抗生素具有低挥发性和高度亲水性的特点,在水环境中稳定性好,污水中残留的四环素可诱导水处理系统中抗生素抗性细菌和基因的产生,对公共健康构成风险[3-4]。四环素类抗生素中,盐酸四环素(TC)、土霉素和金霉素是最常用的[5]。其中TC是一种广谱抗生素,能够在核糖体水平抑制细菌蛋白质合成,进而影响革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的代谢水平和生理活性[6]。长期暴露于含TC的水环境中脱氮微生物会受到不利影响。水体中TC的浓度一般在1 ng/L到129.3 μg/L之间,在制药厂排放的废水中TC浓度可达到11.9 mg/L[7-8]。低浓度的TC对生物处理系统的影响较小,随着TC浓度的不断增加,生物系统所受的影响随之增加。Maria Matos等[9]研究发现50 μg/L TC对硝化过程没有明显影响,而Chen等[10]研究发现0.2 mg/L的TC对生物脱氮的影响较小,且当TC浓度升高到2 mg/L时,反硝化过程受到明显抑制,脱氮效果相应下降。Wang等[11]发现30 mg/L TC不同程度地降低了AMO、NOR、NR和NIR等脱氮相关酶的活性,并诱导了细菌TC抗性的外排泵和酶修饰机制。TC破坏微生物细胞膜完整性,诱导活性氧产生,增强了对微生物的毒性效应,从而抑制了脱氮相关的酶和功能基因的合成[12-13]。刘航[14]研究了TC长期作用对脱氮除磷功能菌的影响时,发现虽然痕量TC虽然不会显著降低生物处理系统的微生物群落丰富度,但会降低微生物群落多样性。Zhang等[15]研究了TC对活性污泥微生物群落和抗生素抗性基因的影响,发现在TC长期暴露下,Actinobacteria和抗生素抗性基因的丰度随TC浓度增加而增加。

目前,多数研究集中于环境浓度(ng/L—μg/L)下TC对活性污泥性能的影响,实际工程中的TC浓度可能达mg/L水平,低浓度的TC不会对细菌产生明显的抗性,但当TC浓度达到mg/L水平时,会导致抗性基因的产生和传递,从而影响污水处理系统的性能。因此,本研究考察了0.5 mg/L TC长期暴露对SBR活性污泥系统污染物去除性能、脱氮相关酶活性和微生物群落的影响,评价了0.5 mg/L TC对微生物的毒性,分析了活性污泥微生物抗氧化酶的响应特征,研究结果可为评估四环素类抗生素的环境风险提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验装置及运行条件

本研究采用实验室规模的SBR作为反应装置,其由有机玻璃制成,直径为14 cm,有效高度为50 cm,有效容积为7.7 L,容积交换比为50%。SBR的运行由时间继电器控制,每天运行3个周期,每个周期包括5 min进水、300 min好氧曝气、140 min缺氧搅拌、30 min沉降和5 min出水。进水由蠕动泵从反应器顶部的进水口泵入,空气通过曝气泵从反应器底部的曝气头通入。好氧阶段SBR中溶解氧(DO)浓度在2～3 mg/L之间。在缺氧阶段,采用磁力搅拌器对SBR中的污泥和废水进行搅拌,DO浓度小于0.5 mg/L。

1.2 接种污泥及水质

本研究接种污泥取自青岛市海泊河污水处理厂二沉池污泥,接种污泥浓度4 000 mg/L,进水根据生活污水人工配制,其具体组分如下(mg/L):CH3COONa(508.0);NH4Cl(158.0);KH2PO4(2.2);微量元素(1 mL/L)。进水COD和氨氮浓度分别为400 mg/L和40 mg/L。微量元素的组成如下(mg/L):H3BO3(1.0);AlCl3·6H2O(1.8);NiCl2·6H2O(1.8);MnSO4·H2O(1.0);CoCl2·6H2O(1.0);CuSO4·5H2O(1.0);ZnSO4·7H2O(1.0)。在加入TC之前,SBR系统经过11 d达到稳定状态,从第12天开始,投加TC使进水中TC浓度为0.5 mg/L。

1.3 分析方法

2 结果与讨论

2.1 TC长期暴露对SBR性能的影响

图1 TC长期暴露对SBR性能的影响

2.2 TC长期暴露对微生物酶活性的影响

((a)AMO和NOR;(b)NR和NIR,“*”表示与未投加四环素的第11天相比具有显著性差异(p<0.05),误差线表示三次实验测量值的标准差。(a)AMO and NOR activities,(b)NR and NIR activities. Asterisks indicate the statistical difference (p<0.05) from the microbial activity under long-term exposure of TC.)

2.3 TC长期暴露对微生物毒性及抗氧化酶的影响

TC长期暴露对微生物酶活性有明显的抑制作用,因此,评价TC长期暴露条件下活性污泥受到的毒性及对微生物抗氧化酶的影响至关重要。ROS的生成量是评价微生物毒性的重要指标之一[20],当受到TC胁迫时,微生物内ROS增加,产生氧化应激反应,破坏活性污泥中微生物的细胞膜。ROS的相对产生量和LDH的相对释放量如图3(a)所示,在添加TC后,ROS的产量在第25天时增加了12%,表明TC使活性污泥细胞产生了轻微的氧化应激反应。与第25天相比,ROS在第42、57和70天时分别增加了32%、45%和62%,说明TC长期作用导致活性污泥产生更多的ROS,微生物的毒性增加。LDH是评价细胞膜完整性的重要指标[21],投加TC后第14天时,LDH释放量显著增加了19%,这说明TC破坏了细胞膜的完整性,投加TC后第31、46和59天时,LDH释放量分别增加了68%、100%和168%,表明TC长期暴露导致细胞膜完整性严重受损,促进LDH产生,进而影响微生物对COD和氮的去除能力。SOD、CAT、POD、APX和GPX是重要的抗氧化酶,主要清除细胞内过量的活性氧,在维持活性氧平衡过程中发挥关键作用[22-26]。TC长期暴露对SOD、CAT、POD、APX和GPX活性的影响如图3(b)所示,反应器运行第25天时,与第11天相比,SOD和GPX相对活性略有升高,CAT、POD和GPX相对活性明显升高。SOD的相对活性在第42、57和70天分别增加了46%、76%和94%,CAT的相对活性分别增加了61%、70%和80%,POD的相对活性分别增加了73%、80%和85%,APX的相对活性分别增加了43%、59%、72%和93%,GPX的相对活性分别增加了73%、122%和230%,这说明TC长期暴露作用下,SOD、CAT、POD、APX和GPX的抗氧化机制均发生明显变化。在本研究中,TC作用初期,CAT、POD和APX活性变化更大,说明CAT、POD和APX发挥更大的作用,随着TC暴露时间的延长,SOD和GPX逐渐发挥更大作用,在消除活性氧方面,这些抗氧化酶相互协同补偿,表明TC长期暴露影响了活性污泥整体的生理活动。

((a)ROS和LDH;(b)SOD,CAT,POD,APX和GPX,“*”表示与未投加四环素的第11天相比具有显著性差异(p<0.05),误差线表示三次实验测量值的标准差。(a) Relative ROS activity and relative LDH release, (b) relative SOD, CAT, POD, APX and GPX activities. Asterisks indicate the statistical difference (p<0.05) from the microbial biotoxicity and antioxidants under long-term exposure of TC.)

2.4 TC长期暴露对微生物群落的影响

在第0、42和70天取SBR中活性污泥样品,分别命名为S0、S42和S70。如表1所示,S0、S42和S70的Goods_coverage均为1,说明测序深度完全覆盖了样品的所有物种。Chao1指数和OTUs数目常用来表示物第70天时Chao1降低至710.8,OTUs数目从1 683降低至709,这表明TC长期暴露明显降低了微生物丰富度。Pielou_e指数常用来表示物种的均匀度,在添加TC之后,污泥的Pielou_e指数逐渐降低,表明TC降低了物种的均匀度。Shannon和Simpson指数分别为9.313和0.995,样品具有较高的多样性和均匀度,在反应器运行第42天时,Shannon和Simpson指数分别降低至7.379和0.965,随着TC暴露时间的延长,Shannon指数继续降低至0.672,表明在TC长期暴露下,微生物群落的多样性和均匀性均降低。

表1 四环素长期暴露对微生物群落的丰富度和多样性指数的影响

((a)门水平;(b)属水平。(a)Phyla level,(b)Genus level.)图4 TC长期暴露下微生物群落在门和属水平上的丰度

2.5 LEfSe分析TC长期暴露下微生物群落的差异物种

为了确定TC长期暴露下产生显著性差异影响的物种类群,本研究进行了LEfSe分析,进一步比较了不同运行时间下起显著作用的微生物。由内到外的圆圈分别表示从门到属的分类级别,在圆圈上标记为不同颜色的节点表示发挥重要作用的微生物。如图5(b)所示,在LDA阈值为4.0处出现41个生物标志物,包括4个门水平微生物、8个纲水平微生物、10个目水平微生物、10个科水平微生物和9个属水平微生物,差异具有统计学意义(P<0.05)。Proteobacteria、Planctomycetota、Acidobacteriota和Acidobacteriota是污水处理厂污泥中的优势微生物。在反应器运行第42天时,微生物在门和纲水平上没有显著性差异,在目水平上,Chitinophagales是S42中的标志微生物,而在科水平上,Saprospiraceae和Comamonadaceae是S42中的标志微生物。在属水平上,Ahniella在接种污泥中发挥重要作用,而在0.5 mg/L TC长期影响下,在反应器运行第70天时,Zoogloea、Thauera、Dechloromonas和Candidatus_Competibacter成为了标志微生物,Zoogloea、Thauera和Dechloromonas均是参与反硝化作用的相关属,说明在0.5 mg/L TC长期暴露下,这些属具有较好的耐受性。以上结果表明在0.5 mg/L TC长期作用下,微生物群落具有显著性差异。

((a)进化分枝图,(b)LDA值分布柱状图。(a) A cladogram of the all samples,(b) The LDA score of the abundant biomarkers from all samples.)

2.6 盐酸四环素长期暴露对微生物群落共现性的影响

本研究以接种污泥为对照,在微生物属水平上构建网络图,确定了关键微生物。节点数量和平均节点相邻数可以反映微生物网络系统的复杂性和稳定性[41]。如表2所示,在S42中,节点数量和平均节点相邻数分别为29和23.586,在S70中,节点数量和平均节点相邻数分别为30和24.667,随着反应器运行时间的延长,微生物网络的稳定性逐渐增强。聚类系数和网络密度可以反映网络图的重要性质,S70的聚类系数和网络密度高于S42,说明在TC长期作用下,微生物之间的作用关系更加复杂。在网络图中,微生物之间存在着正相关和负相关,正相关表示微生物之间的合作行为,负相关表示微生物之间的捕食和竞争关系[42]。如图6所示,TC长期暴露改变了微生物在生态位中的作用,在S42中,正相关的比例为46%,而在S70中,正相关比例为55%,这可能是因为在TC长期胁迫下,微生物间相互合作,以保持微生物系统的稳定性。网络结构的改变可能导致微生物的变化,根据网络拓扑结构确定了具有较高中心度的关键微生物。微生物网络与生态系统功能紧密相关,在TC长期暴露下,SBR活性污泥的关键微生物存在显著差异,当反应器运行至第42天时,SBR活性污泥中关键微生物包括Acidibacter、Thiothrix、JG30-KF-CM45、OLB14和Conexibacter,而在第70天时,SBR活性污泥中关键微生物包括Conexibacter、Sulfuritalea、RBG-13-54-9、Candidatus_Accumulibacter和Dokdonella。Conexibacter能将硝酸盐还原为亚硝酸盐[43],Lei等[44]研究发现Conexibactersp. LD01可以以林可霉素作为唯一的碳源、氮源和能源生长。尽管S42和S70中关键微生物不一致,但Conexibacter在投加TC后第31—59天一直是反应器中的关键微生物,其在S0、S42和S70中的相对丰度分别为1.13%、0.26%和0.14%,虽然其在TC长期暴露下不是丰度最高的微生物,但Conexibacter仍然发挥着重要作用。Candidatus_Accumulibacter和Dokdonella分别是与生物除磷过程和反硝化过程相关的微生物,在TC长期暴露下,Candidatus_Accumulibacter的相对丰度逐渐升高,Dokdonella的相对丰度逐渐降低,关键微生物及其丰度的变化说明在投加TC后第59天时,反应器的脱氮除磷性能发生变化。虽然有些关键微生物在活性污泥中的相对丰度并不高,但之前的研究也发现低丰度的微生物可能在生物反应器中发挥重要作用[45]。因此,在今后的研究中,应更加关注关键微生物的作用,将关键微生物之间的相互关系和反应器性能联系起来。

表2 TC长期暴露下的网络拓扑特性

((a)运行时间从第0天至第42天,(b)运行时间从第0天至第70天,选择了相对丰度前30的属,蓝色实线表示显著正相关(r>0.85),红线表示显著负相关(r<-0.85),节点大小代表每个属的丰度。(a) Operation time from Day 0 to Day 42, (b) Operation time from Day 0 to Day 70, the top 30 genera with relative abundances were selected. Blue solid lines represent significantly strong positive (r>0.85) linear relationships and red lines represent strong negative (r<-0.85) linear relationships. Node sizes represent the abundances of each genus.)

3 结语